Para começar, corte o papel de filtro em uma forma retangular de aproximadamente 17 por 20 milímetros e remova os quatro cantos. Em seguida, crie aproximadamente sete por 10 milímetros de centro oco no papel de filtro. Conecte um anel disponível comercialmente a uma camada de filme flexível e crie um centro oco na camada de filme flexível.
Coloque um anel preparado em uma placa de Petri de 35 milímetros. Após o pré-cultivo, retire o ovo da incubadora e coloque-o em seu longo eixo na bandeja da caixa de ovos. Limpe toda a superfície da casca do ovo com etanol 70% e deixe descansar por 15 minutos.
Segure o ovo em seu eixo curto e quebre-o no fundo. Abra o ovo sobre uma placa de Petri limpa de 100 milímetros para extrair seu conteúdo. Usando uma pipeta, transfira aproximadamente 10 mililitros da albumina fina para um tubo de 15 mililitros para cultura ex ovo.
Preencha bem o centro do prato de cultura com albumina fina. Usando papel de seda, remova suavemente a albumina espessa ligada à membrana vitelínica do embrião. Agora, afixe cuidadosamente o papel de filtro na membrana vitelina, garantindo que o eixo do corpo do embrião se alinhe com o retângulo central no papel de filtro.
Corte a membrana que envolve o papel de filtro com uma tesoura. Usando uma pinça, puxe suavemente o papel de filtro isolado para longe do jugo em uma direção oblíqua. Vire o papel de filtro de cabeça para baixo para posicionar o embrião com o dorsal para baixo.
Mergulhe cuidadosamente todo o papel de filtro de um lado do eixo longo na placa de Petri de 100 milímetros contendo meio de lavagem. Usando uma pipeta limpa, borrife suavemente o meio de lavagem paralelo ao papel de filtro para remover qualquer gema residual. Em seguida, remova cuidadosamente o papel de filtro do meio de lavagem e use papel de seda para absorver qualquer meio em excesso das bordas do embrião.
Coloque o papel de filtro com o embrião na placa de cultura, garantindo que o lado dorsal do embrião esteja voltado para baixo. Transfira o prato de cultura para a incubadora no palco para a cultura ex ovo. Encha os pratos de cultura com um meio de lavagem quente.
Quando o embrião atingir o estágio de desenvolvimento desejado, transfira o papel filtro com o embrião para a placa de cultura preenchida com um meio de lavagem. Coloque a placa de cultura na incubadora do palco do microscópio Brillouin. Para o processo de calibração, meça o sinal Brillouin da água.
Em seguida, meça o sinal Brillouin do metanol. Sob imagens de campo brilhante com uma lente objetiva quatro vezes, ajuste o ponto de iluminação a laser para o segundo par de somitos. Em seguida, mude para uma lente objetiva 40 vezes e realize o ajuste fino do ponto laser para o meio do tubo neural.
Desbloqueie o feixe de laser e ajuste o plano focal. Digitalize o embrião usando um estágio de translação bidimensional e adquira uma imagem Brillouin da região de interesse. Depois de completar a digitalização, remova cuidadosamente o papel de filtro com o embrião.
Use papel higiênico para absorver qualquer meio de lavagem em excesso do embrião. Coloque o embrião de volta na placa de cultura cheia de albumina fina para cultivo contínuo. Para a reconstrução da imagem de Brillouin, carregue os dados do sinal de água e metanol.
Clique em definir região e selecione a região com quatro pontos para calcular os parâmetros de calibração. Salve os resultados da calibração. Carregue os dados de digitalização de embriões e clique em Iniciar para o processamento dos parâmetros.
Finalmente, reconstrua a imagem Brillouin 2D com base nos deslocamentos Brillouin de todos os pixels. O desvio de Brillouin no módulo longitudinal estimado da placa neural contra o número de somitos e o tempo de incubação mostrou um aumento no desvio de Brillouin do tecido durante o fechamento do tubo neural.
