Comece mantendo as células HEK-293T ACE2 TMPRSS2 em DMEM contendo FBS ativado aquecido, penicilina e estreptomicina em um frasco T75. Para a contagem de células, misture 20 microlitros de suspensão celular com 20 microlitros de solução de Azul de Trypan. Adicione 20 microlitros de suspensão de células mistas à câmara de contagem de células e conte o número de células por mililitro.
Seme 2,5 vezes 10 à potência de quatro células de TMPRSS2 HEK-293T ACE2 em 50 microlitros de meio DMEM completo em cada poço de uma placa de 96 poços. Incubar as células em uma incubadora de dióxido de carbono durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, substitua os 50 microlitros de DMEM por 50 microlitros de suspensão do vírus e incube por 18 horas a 37 graus Celsius.
Após a incubação, adicione 7,5 microlitros de tampão de lise celular a cada poço e misture em um agitador orbital por dois minutos. Uma vez que as células estejam lisadas, adicione a solução de ensaio de luciferase de vagalume recém-preparada e misture-as em um agitador orbital por um minuto. Analise a atividade da luciferase usando um leitor comercial de microplacas de luciferase.
Para o ensaio de anticorpos neutralizantes, semeie células HEK-293T em 50 microlitros de DMEM completo, conforme demonstrado anteriormente. Em uma placa de 96 poços, adicione oito microlitros de 27 anticorpos neutralizantes BV e realize diluições seriadas com seis microlitros de DMEM livre de soro. Adicione 54 microlitros de partícula do vírus Ha-CoV-2 ao anticorpo diluído em série e misture a suspensão.
Incubar durante uma hora a 37 graus Celsius em dióxido de carbono a 5%. Em seguida, adicione 50 microlitros de suspensão de vírus aos poços contendo células HEK-293T. Para controles, adicionar 50 microlitros de meio DMEM completo nos poços contendo apenas células HEK-293T.
Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por 18 horas. Depois de lisar as células, como demonstrado anteriormente, adicione a solução de ensaio de luciferase de vagalume recém-preparada e misture por agitação orbital por um minuto. Analise a atividade da luciferase usando um leitor comercial de microplacas de luciferase.
As variantes Ha-CoV-2 Omicron e Omicron geraram sinal quatro a dez vezes maior do que o Ha-CoV-2 do tipo selvagem, sugerindo maior infectividade. O anticorpo 27 BV demonstrou atividade neutralizante contra as variantes Delta e Omicron. O ID50 de 27 BV para Omicron foi aproximadamente 10 vezes menos potente que o ID50 para Wild-type e Delta.
