Comece ressuspendendo o peptídeo MOG 35 55 liofilizado em água. Diluir o estoque de peptídeos para 10 microgramas por mililitro no tampão de revestimento antes do experimento. Agora pipete 100 microlitros da solução final em poços de uma placa de 96 poços.
Cubra simultaneamente um número igual de poços com 100 microlitros de BSA dissolvido no tampão de revestimento. Sele a placa com uma película adesiva para evitar a evaporação e incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, faça três lavagens da placa com 200 microlitros de PBS suplementados com 0,5% entre 20.
Posteriormente, adicione 100 microlitros por poço de uma solução de bloqueio composta por 3% BSA em PBS. Incube a placa selada por uma hora a 37 graus Celsius em um forno de hibridização. Após a incubação, lave a placa três vezes com 200 microlitros por poço de PBST.
Dilua cada amostra de soro obtida do sangue de camundongos imunizados com EAE em solução de bloqueio e adicione 100 microlitros por poço aos poços revestidos com MOG 35, 55 e BSA. Adicione o mesmo volume de solução de bloqueio aos poços em branco designados. Incube a placa selada por duas horas em temperatura ambiente com agitação constante.
Após a incubação, retire a placa da incubadora e enxágue a placa três vezes com 200 microlitros por poço de PBST. Dilua o anticorpo secundário conjugado HRP em uma solução que consiste em 0,2% BSA em PBST e adicione 100 microlitros a cada poço. Incube a placa selada por uma hora em temperatura ambiente, mantendo agitação constante.
Lave a placa três vezes com 200 microlitros por poço de PBST. Adicione 100 microlitros de substrato de tetrametilbenzidina de três, três primos, cinco, cinco primos a cada poço. Incube no escuro por um a cinco minutos monitorando o desenvolvimento de uma cor azul.
Adicione 100 microlitros de solução de parada a cada poço. Em seguida, use um leitor de placas ajustado em um comprimento de onda de 450 nanômetros para medir a densidade óptica em cada poço. Os valores de densidade óptica das amostras EAE foram significativamente maiores do que as amostras controle, indicando uma resposta robusta de imunoglobulina G contra o peptídeo MOG.
