Após isolar os neutrófilos do sangue periférico humano, ressuspendê-los em meio RPMI 1640 em tubo centrífugo de 1,5 mililitro. Adicione um microlitro de DNA vermelho permeável à membrana a 1,5 mililitros de suspensão de neutrófilos e incube no escuro por cinco minutos. Centrifugar a suspensão de neutrófilos a 2.500g durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Após a centrifugação, retirar o tubo contendo neutrófilos peletizados e aspirar o sobrenadante. Ressuspenda os neutrófilos em um mililitro de RPMI e centrifugue-o novamente. Após a última lavagem, ressuspender os neutrófilos em um mililitro de RPMI.
Adicione um pequeno volume de suspensão de neutrófilos ao hemocitômetro e conte-os ao microscópio. Diluir a suspensão de neutrófilos para 1,5 vezes 10 a quinto neutrófilos por mililitro usando RPMI. Adicione quatro microlitros de um a 100 corantes de DNA verde impermeável de membrana pré-diluídos ao mililitro de suspensão de neutrófilos.
Dispensar 100 microlitros de suspensão de neutrófilos por poço em uma placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos transparentes. Adicionar 100 microlitros de RPMI contendo reagentes de estímulo com ou sem inibidor nos respectivos poços. Coloque a placa em um sistema de análise de células vivas alojado em uma incubadora de dióxido de carbono a 5%.
