Para começar, inicie o software do sistema de análise de células ao vivo. Pressione o símbolo de adição no canto superior esquerdo da tela para iniciar o recipiente de adição. Escolha Digitalizar sob agendamento e, em seguida, selecione Novo para executar o programa de digitalização.
Selecione Padrão. Em seguida, defina as configurações de varredura como opções célula a célula como Nenhuma e canais de imagem como Fase, Verde e Vermelho, com os respectivos tempos de aquisição. Defina o objetivo para 20x.
Na lista, escolha a placa e selecione o local do vaso para colocar a placa na bandeja do sistema de imagem. Selecione os poços que contêm amostras e decida o número de imagens a serem capturadas por poço. Essa informação gera automaticamente uma duração estimada de varredura para a placa.
Clique em Criar Mapa de Placas para inserir informações para cada poço, como tipo de célula e composto. Em seguida, nomeie o estudo. Na tela seguinte, selecione Analisador Básico como o tipo de análise e escolha Definição de análise na lista suspensa, que mostra as definições de análise usadas anteriormente.
Deixe a desmistura espectral para verde e vermelho em 0,0. Agende a varredura para ocorrer a cada 15 a 20 minutos por oito horas. Arraste a barra branca e cinza na parte superior da tela para definir a hora de início da varredura.
Na tela seguinte, revise as configurações de varredura e pressione Adicionar à Agenda para iniciar a digitalização. Após a digitalização, na guia Exibir, abra o recipiente para análise. Pressione Iniciar análise à esquerda da tela e selecione Criar nova definição de análise.
Escolha Analisador Básico e use os canais de imagem Fase, Verde, Vermelho e Sobreposição. Selecione de seis a oito imagens de amostra representativas para treinamento. Para configurar a definição de análise, defina objetos verdes para neutrófilos formando armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs, e objetos vermelhos para os núcleos de todos os neutrófilos.
Pressione Visualizar atual ou Visualizar tudo e ajuste cada parâmetro para otimizar os resultados. Escolha os tempos de varredura e os poços para análise. Em seguida, forneça um rótulo para a definição de análise.
Revise o resumo e inicie a análise. Após a análise, clique duas vezes no nome da definição da análise para abrir o estudo analisado. Abra Camadas à esquerda da tela e verifique se cada célula está marcada corretamente.
Clique em Métricas do gráfico à esquerda da tela e selecione contagem por imagem para contagem verde. Escolha os pontos de tempo e poços a serem exportados. Para selecionar o agrupamento, selecione Replicações de mapa de placa para confirmar se todos os poços estão especificados corretamente durante a varredura e clique em Exportar dados.
Da mesma forma, exporte os dados para contagem vermelha e contagem de sobreposição. Usando a equação dada, calcule a porcentagem de NETs formando células para cada condição e ponto de tempo. O curso temporal da formação de NET é visualizado plotando a porcentagem de neutrófilos formadores de NET em cada ponto de tempo.
A adição de um inibidor de AKT bloqueou a formação de NET em neutrófilos estimulados com PMA ou ionóforo de cálcio. A demonstração das moléculas potenciais que visam a formação de NET pode ser testada de uma maneira de alto rendimento usando esta metodologia.
