Criação do Mapa de Navegação para CLEM e Preparação das Seções Ultrafinas para Microscopia Eletrônica

Para começar, pegue uma seção ultrafina de tecido cerebral de camundongo expressando mScarlet. Adicione 10 microlitros de tampão de montagem na seção ultrafina no vidro da tampa e coloque um novo vidro de tampa limpa no buffer de montagem. Coloque os dois óculos de cobertura com a seção ultrafina em uma câmara de imagem.

Localize a seção usando o marcador do anel no modo de imagem de campo brilhante de um microscópio de fluorescência invertida e mova-se para um canto da seção. Ligue a luz branca e capture a imagem de campo brilhante. Em seguida, apague a luz branca.

Ative o laser e capture imagens fluorescentes do mesmo campo de visão. Desative o laser e mova-se para o campo de visão adjacente com uma sobreposição de 10%. Capture o campo brilhante e a imagem fluorescente do segundo campo de visão e registre o caminho da imagem para costurar o campo de visão.

Agora use o mapa de navegação para segmentar as células de interesse. Ative o laser e capture 300 quadros de imagens fluorescentes da célula de interesse. Em seguida, desative o laser.

Depois, ative a luz branca e tire aproximadamente 100 imagens sequenciais de campo brilhante. Para preparar as seções para microscopia eletrônica, encha um frasco de vidro com água bidestilada. Remova os vidros de cobertura que seguram as seções ultrafinas da câmara de imagem e separe-os com uma pinça.

Aperte o vidro da tampa com a seção. Lave o tampão de montagem com água bidestilada e deixe secar. Usando uma lâmina de lado único, marque um hash ao redor da seção ultrafina.

Solte 10 microlitros de ácido fluorídrico a 12% em cada canto da pontuação. Coloque lentamente o vidro de cobertura na água. Em seguida, flutue o filme pioloforme e a seção ultrafina na superfície da água.

Coloque uma grade de slot não revestida na seção para capturá-la no centro da grade. Cubra uma lâmina de vidro com paraforma. Pegue a grade com o filme pioloforme e deixe secar ao ar livre à temperatura ambiente.