Para começar, prepare uma solução de colágeno IV de um miligrama por mililitro em água e adicione 95 microlitros dessa solução a cada poço de uma lâmina de câmara inferior de imagem de 10 poços. Incube a lâmina a 37 graus Celsius por 30 minutos a duas horas para revestir os poços. A partir da cultura de organoides intestinais humanos 3D, remova o meio de manutenção WRNE dos poços cinco a sete dias após a última passagem.
Em seguida, adicione 500 microlitros de 1xPBS contendo 0,5 milimolar de EDTA por poço. Usando uma ponta pré-codificada de um mililitro, pipetar suavemente para desprender o BMM da placa. Transfira a suspensão para um tubo cônico pré-codificado de 15 mililitros.
Enxágue cada poço com mais 500 microlitros da solução PBS EDTA. Centrifugar a suspensão e remover o sobrenadante e o BMM residual. Em seguida, use uma ponta pré-codificada para ressuspender o pellet em três mililitros de PBS contendo EDTA de cinco milimolares.
Centrifugar novamente e ressuspender em dois mililitros de tampão de dissociação enzimática. Incubar o tubo a 37 graus Celsius durante cinco minutos. Em seguida, adicione três mililitros de CMGF-com 10%FBS e misture delicadamente.
Centrifugar e adicionar um mililitro de CMGF-ao pellet. Pipetar vigorosamente a mistura 80 a 100 vezes para quebrar os organoides em células únicas. Centrifugar e ressuspender o pellet em um mililitro de meio WRNE.
Obter uma contagem de células e diluir a suspensão celular para atingir 1,25 vezes 10 para as cinco células em 100 microlitros. Em seguida, retire a solução de colágeno da placa previamente preparada, evitando tocar no fundo do poço. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução de célula preparada por poço.
Incubar por 24 horas em incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius. Substitua o meio por 100 mililitros de meio de diferenciação por poço a cada 24 horas até a confluência. Após esse ponto, as monocamadas estão prontas para aplicações downstream.
