1 Para começar, obtenha as células coradas com ligante2 expressando a proteína de interesse marcada com halo e o halo H2B. 3 Depois de ligar o sistema de microscópio, 4 defina os parâmetros de incubação de células vivas 5 e deixe o sistema se equilibrar. 6 Coloque uma gota do óleo em 7 uma objetiva TIRF de 100x no microscópio 8 e carregue a célula sample no microscópio stage.
9 Para identificar uma célula morfologicamente saudável, 10 ajuste a posição Z 11 e obtenha imagens da amostra de célula sob iluminação de campo claro. 12 Corte o campo de visão para capturar o núcleo da célula-alvo. 13 Usando a iluminação a laser, ajuste o ângulo TIRF 14 para obter a iluminação hilo com uma relação sinal-ruído ideal de 15 de uma única molécula.
16 Em seguida, defina o tempo de exposição para 500 milissegundos. 17 Durante o tempo morto entre os quadros, 18 fotoativam as moléculas 19 com um feixe de 111 microwatts e 405 nanômetros, 20 e durante cada exposição, excitam as moléculas de halo H2B 21 com um feixe de 9,1 miliwatts e 640 nanômetros. 22 Inicie a captura de imagens para 2000 quadros continuamente 23 e aumente gradualmente a potência do feixe de 405 nanômetros 24 após a redução de moléculas fotoativadas.
25 Para uma proteína de interesse marcada com halo, 26 comprimentos de onda de emissão divididos entre duas câmeras 27 usando um espelho dicróico de longa passagem. 28 Aos mesmos parâmetros de aquisição demonstrados anteriormente, 29 adicione o canal JFX549 para adquirir um quadro a cada 10 segundos 30 e capturar 2000 quadros continuamente.
