1 Para começar, executea imagem de molécula única de célula viva 2 dos condensados de proteína HaloTag. 3 Usando o ImageJ, converta cada canal 4 do arquivo de dados de imagem bruta 5 em um arquivo TIFF independente. 6 Se necessário, execute o pente de pré-rastreamento.
Envie uma mensagem de texto 7 e siga as instruções 8 para substituir os quadros pelos mais recentes. 9 Para carregar a única molécula de arquivo de filme no SlimFast, 10 clique em carregar, seguido pela pilha de imagens. 11 Defina os parâmetros para localização 12 e aquisição nas respectivas folhas de opções.
13 Visualize as localizações de todas as moléculas. 14 E usando bloquear tudo, 15 gera um arquivo contendo as localizações 16 de todas as moléculas em cada quadro. 17 Em seguida, vá para carregar dados de partículas 18 e selecione SlimFast para carregar o arquivo 19 com configurações de localização e aquisição.
20 Usando a opção e o rastreamento de folha, 21 ajuste os parâmetros para a geração da trajetória. 22 Clique em gen traj para gerar um arquivo 23 contendo as trajetórias de todas as moléculas. 24 Carregue o arquivo rastreado da planilha no eval SPT 25 e defina os parâmetros 26 para filtrar as trajetórias menores que 2,5 segundos.
27 Usando dados de exportação, gere um arquivo 28 com todas as trajetórias filtradas. 29 Executando a macro ImageJ, núcleo, 30 e máscara de cluster versão dois. texto, 31 limite todos os quadros do filme adquiridos 32 no canal JFX549 para gerar um filme de lapso de tempo 33 preenchido com a máscara binária em evolução do tempo 34 destacando locais de condensado.
35 Usando converter ASCII rastreamento lento CSS 3. M, 36 reformatar as trajetórias 37 e executar a categorização versão 4. M 38 para classificá-los com base no tempo de vida 39 que uma molécula gasta em um condensado.
40 Em seguida, usando a residência do enredo hist CSS. M, 41 extraem a taxa de dissociação observada 42 de moléculas especificamente ligadas 43 e a taxa de fotobranqueamento da proteína condensada 44 de interesse e das trajetórias H2B. 45 Finalmente, calcule o tempo médio de residência corrigido 46 da proteína de interesse, 47 especificamente ligada aos seus condensados.
48 Um quadro do filme de molécula única de duas cores 49 do TAF15 IDR-Halo-FTH1 mostra sinais 50 do núcleo nos canais PA-JF646 e JFX549. 51 Ao montar e classificar, 52 uma distinção clara foi observada para as trajetórias 53 de PA-JF646 detectaram moléculas ligadas aos condensados. 54 Os tempos médios de residência calculados 55 após a correção para fotobranqueamento 56 foram maiores para TAF15-Halo-FTH1 do que para Halo-TAF15.
