Para começar, ligue a máquina de perifusão. Inicie o software de perifusão, insira a contagem de câmaras e, em seguida, rotule as soluções de entrada. Agora conecte a tubulação de entrada e saída da máquina de perifusão.
Em seguida, três fatias de tecido pancreático humano embebidas em agarose sob um microscópio estéreo. Use um pincel e bisturi para aparar a agarose dos tecidos ao mínimo. Adicione uma gota do buffer de linha de base na grade de uma câmara de fatia.
Transfira delicadamente cada fatia para cada grade. Monte as partes individuais da câmara de fatia de cima para baixo. Para estudar ilhotas isoladas, use um mínimo de 30 ilhotas por coluna para secreção de insulina, ou 100 ilhotas para detecção de glucagon, e adicione ilhotas à câmara preenchida com tampão de linha de base.
Aparafuse a tampa na parte superior para fechar a câmara da ilhota. Em seguida, clique na guia de etapas. Insira o número de linhas, defina o tempo da etapa para 90 minutos e clique em aplicar.
Depois de adicionar as etapas para todas as soluções, pressione a guia de visão geral para ver a visão geral do protocolo. Pressione a guia mapa de placas para visualizar a representação visual da placa. Comece a preparar as células com as soluções de carregamento.
Use a bomba de aquecimento da câmara e resfriamento da bandeja durante a perifusão. Monitore as câmaras quanto a um fluxo e bolhas precisos. Troque as placas de coleta durante o protocolo.
Armazene as bandejas a quatro graus Celsius para quantificação no mesmo dia. Após a conclusão da perifusão, desmonte as câmaras e inverta suavemente cada parte em um prato contendo tampão de linha de base para coletar as fatias. Transfira as fatias para um tubo para lise ou fixação.
Lave a máquina com água, alvejante a 10% e uma combinação de água e ar para limpá-la. Dilua o corante de cálcio preparado em três mililitros de solução tampão HEPES basal em uma placa de Petri de três centímetros de largura. Adicione aprotinina na solução de corante diluída.
Em seguida, transfira uma única fatia para a solução. Incube a fatia no escuro por 30 minutos a uma hora em um agitador orbital em temperatura ambiente. Enquanto isso, conecte as seringas de perifusão cheias e o tubo.
Ligue o aquecedor do instrumento e ajuste o fluxo da bomba a uma vazão de 0.5 mililitros por minuto. Agora, coloque suavemente uma única fatia na câmara de imagem do microscópio confocal. Prenda a fatia com uma harpa.
Conecte a tubulação de entrada e saída à câmara e ligue a bomba. Identifique a área de imagem sob baixa ampliação usando reflexão. Em seguida, mude para uma objetiva de ampliação mais alta e ajuste a posição de acordo.
Defina a resolução para um mínimo de 256 por 256, o intervalo de imagem entre cinco a 10 segundos e a faixa da pilha Z para 30 a 60 micrômetros, com um intervalo de 10 micrômetros entre os planos. Comece a imagem com a troca de solução de acordo com o experimento. A secreção hormonal dinâmica foi observada na fatia viável, resultando em secreção robusta de insulina.
A secção tardia da má qualidade do tecido resultou em resposta diminuída ou ausente à alta glicose e despolarização da membrana. Um mapa de calor gerado por mudanças de intensidade durante a imagem de cálcio mostrou células que respondem após mudar para o aumento da concentração de glicose.
