Para começar, ative o software de geração de imagens. Abra a janela Adquirir. Defina o tempo de exposição para 500 milissegundos, a área da câmera para o chip completo e o binning para um, em seguida, defina a iluminação para o canal necessário.
Para agitação citoplasmática, use a luz transmitida para se concentrar no nucléolo do ovócito. Para experimentos com speckle nuclear, concentre-se em gotículas SRSF2 GFP. Para otimizar a velocidade de aquisição, na guia Especial, defina o obturador da câmera para abrir para exposição e o modo claro para limpar a pré-sequência.
Em seguida, abra a janela Aquisição de fluxo. Na guia Adquirir, defina o modo de aquisição para transmitir para RAM e o número de quadros como 480. Defina os parâmetros da câmera para adquirir imagens na taxa de quadros e o número de quadros para pular para zero.
Na guia Parâmetros do controlador da câmera digital, defina o estado da câmera para parar, o modo do obturador para abrir nunca, o modo de desmarcar para limpar a pré-sequência e o número de quadros para média de um. Em seguida, ajuste uma região de interesse ao redor do objeto. Na janela Aquisição de fluxo, clique em Adquirir para iniciar o filme.
Após a aquisição, salve o filme como um arquivo tiff. Para análise de imagens, abra ImageJ ou Fiji. Nos plugins, clique em CIRB e abra o menu Verlhac e, em seguida, selecione Forma do Núcleo do Oócito.
Na caixa de diálogo, selecione a pasta que contém os filmes a serem analisados. Em seguida, selecione o ângulo e as margens para corte. Agora, selecione a calibração XY e o intervalo de tempo, em seguida, clique em OK.To plotar a forma média ao longo do tempo, na planilha, calcular o raio médio R sobre todos os pontos de tempo T para cada ângulo definido.
Para cada T e, subtraia o raio médio R ao longo do tempo do raio minúsculo r. Finalmente, calcule a média das flutuações para todos os pontos de tempo T e todos os ângulos para cada núcleo e todos os núcleos de uma condição. Nos ovócitos controle, o núcleo apresentou flutuações periféricas significativas visualizadas com a sonda nuclear YFP Rango.
Em contraste, o núcleo em ovócitos com forças citoesqueléticas interrompidas permaneceu estável ao longo do tempo. A variância da distância do centroide do núcleo à sua periferia revelou um aumento de seis vezes nos ovócitos de controle em comparação com aqueles com forças citoesqueléticas interrompidas. Manchas nucleares nos ovócitos controle mostraram maior flutuação nas superfícies das gotículas em comparação com as forças citoplasmáticas rompidas.
