Para iniciar o revestimento do antígeno, dilua a ovalbumina a cinco microgramas por mililitro com um tampão de revestimento. Cubra uma placa ELISA de 96 poços com 100 microlitros de solução de ovalbumina por poço durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave os poços cinco vezes com PBST.
Bloqueie os poços com 250 microlitros de 1% BSA PBST a 37 graus Celsius por duas horas. Para preparar uma diluição de soro de 1000 X, primeiro dilua 20 microlitros de soro em um mililitro usando 0,5% BSA PBST. Em seguida, remova 25 microlitros de alíquota de soro e dilua-a para 500 microlitros usando 0,5% BSA PBST.
Adicione 200 microlitros de soro diluído a 1000 X à primeira fileira da placa revestida. Em seguida, adicione 100 microlitros de 0,5% BSA PBST a todos os poços, exceto os poços na primeira linha. Transfira 100 microlitros da primeira linha para a segunda linha e misture 10 vezes.
Para criar concentrações variadas de soro para detecção de IgG, descarte 100 microlitros de líquido da última linha. Em seguida, dilua a lavagem vaginal de camundongos, lavagem alveolar brônquica, fluidos de lavagem nasal com 0,5% BSA PBST e fluido de lavagem do intestino delgado com 20% de PBST sérico fetal de bezerro. Incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora.
Lave os poços cinco vezes com PBST. Adicione 100 microlitros de anticorpo anti-camundongo de cabra conjugado HRP aos poços apropriados e incube a 37 graus Celsius por 40 minutos. Depois de lavar os poços cinco vezes com PBST, adicione 100 microlitros de substrato TMB ELISA e incube em uma área protegida da luz por cinco minutos.
Adicione 100 microlitros de solução de parada de 450 nanômetros para encerrar a reação. Meça a absorbância em 450 nanômetros em um leitor de microplacas. Calcule o título de anticorpos definindo um valor de resposta positivo como 2,1 vezes o valor sérico do grupo de camundongos de controle.
A vacina adjuvante de nanoemulsão aumentou significativamente os títulos de anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a específicos para ovalbumina no soro. Os níveis de IgA específica no líquido de lavagem vaginal e no fluido de lavagem do intestino delgado foram significativamente aumentados quando a ovalbumina foi adjuvante com ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica.
