Para começar, use um lápis de diamante para dividir uma tampa de vidro padrão em três tiras iguais. Use graxa a vácuo para colar um pedaço da tira deslizante da tampa no fundo de um suporte de câmara caseiro. Da mesma forma, prenda a segunda peça da tira deslizante da tampa na parte superior do suporte da câmara.
Em seguida, use uma pistola de pipeta para injetar 200 microlitros da suspensão RBC rotulada entre as duas tampas. Para montar a configuração de aspiração da micropipeta, monte a câmara celular no estágio do suporte em uma plataforma de microscópio. Ajuste a posição da câmara até que ela fique diretamente abaixo da objetiva.
Agora abaixe o suporte até que ele esteja abaixo do nível de fluido do reservatório de água conectado. Injete água desmineralizada na micropipeta e, em seguida, use uma seringa equipada com uma agulha de calibre 34 para remover quaisquer bolhas de ar. Desparafuse a extremidade do suporte da micropipeta até a metade e deixe a água escorrer do suporte por alguns segundos.
Em seguida, insira a micropipeta cheia de suspensão na ponta do suporte e aperte o parafuso do suporte. Coloque a micropipeta na câmara celular. Em seguida, localize a pipeta e as hemácias sob o microscópio.
Abaixe a ponta da pipeta para garantir que ela esteja nivelada com o RBC localizado. Ajuste a altura do reservatório de água para zerar a pressão hidráulica na ponta. Em seguida, eleve ligeiramente o reservatório de água para gerar uma pressão positiva sutil.
Ligue a fonte de luz de excitação fluorescente de 488 nanômetros. Ligue a câmera fluorescente e a câmera transmitida. Insira o tempo de exposição, a região de interesse e o tamanho da lixeira para ambas as câmeras no software correspondente.
Em seguida, configure o número de aquisição para 2000 no painel Aquisição Multidimensional. Escolha o diretório de salvamento necessário. Em seguida, localize a micropipeta com a ajuda do micromanipulador.
Ligue a braçadeira de pressão pneumática e certifique-se de que a caixa de controle esteja no modo externo. Gire lentamente o botão para compensar qualquer pressão de deslocamento dentro do sistema. Inicie o software que controla a braçadeira pneumática.
Use o painel de controle elétrico para manter a pressão controlada com um fator de conversão de mercúrio de 20 milivolts por milímetro. Agora zere a pressão dentro do sistema e, em seguida, realoque cuidadosamente a micropipeta perto das hemácias. Ajuste a posição do reservatório de água para gerar uma pressão positiva sutil na ponta da micropipeta.
Inicie a aquisição no software da câmera e ligue o obturador de fluorescência. Digite a magnitude da tensão calculada no painel de controle para atingir a pressão desejada e aspirar uma hemácia. Segure a pressão por um período predefinido e, em seguida, solte-a.
Da mesma forma, repita o experimento com o próximo eritrócito antes de uma análise mais aprofundada. O aumento incremental da pressão resultou em um aumento da mobilização de íons cálcio para as hemácias.
