Pré-aquecer um mililitro de caldo LB e um LB mais placa de ágar gentamicina para cada amostra e controlar em uma incubadora estática regulada a 37 graus Celsius. Em um volume combinado de cinco microlitros ou menos, adicione 100 a 200 nanogramas cada um do plasmídeo auxiliar pTNS2 e o plasmídeo de inserção de gentamicina adeIJK pUC18-Tmini-Tn7-Tlac a uma alíquota de células eletrocompetentes. Misture com batidas suaves na ponta dos dedos para garantir a mistura completa dos plasmídeos com as células eletrocompetentes sem introduzir bolhas.
Adicione um volume equivalente de água destilada estéril na alíquota da célula de controle negativo e misture delicadamente como mostrado anteriormente. Incubar as amostras no gelo por 20 minutos. Transfira toda a amostra de células para uma cubeta de eletroporação gelada e, em seguida, coloque a cubeta de volta no gelo.
Para eletroporar a amostra de célula, ligue o eletroporator e configure-o para dois quilovolts. Limpe a superfície da cubeta com um tecido macio para remover qualquer gelo ou umidade aderente. Insira a cubeta no eletroporator e dê o choque elétrico.
Adicione imediatamente 0,9 mililitros de caldo LB pré-aquecido às células na cubeta e pipete suavemente para cima e para baixo para misturar as células com o meio. Transfira toda a suspensão da célula para um novo tubo de microfuga de 1,5 mililitro à temperatura ambiente. Em seguida, verifique o valor da constante de tempo no eletroporador.
Para melhores resultados, esse valor deve estar entre quatro e seis. Incubar as amostras eletroporosas a 37 graus Celsius por uma hora a 250 RPM para permitir a recuperação celular. Após uma hora, espalhar 100 microlitros de cada amostra em uma placa de ágar LB mais gentamicina pré-aquecida, usando um espalhador de inoculação.
Incubar as placas a 37 graus Celsius por 16 a 18 horas. Verifique as placas de eletroporação. Usando palitos estéreis, pegue até 10 colônias únicas das placas de ágar LB mais gentamicina e remende-as em uma placa de ágar LB mais gentamicina fresca.
Incubar as placas a 37 graus Celsius por 16 a 18 horas. O remendo de colônias de placas de transformação em meios seletivos preserva a cepa transformada e fornece material de partida para a triagem de PCR de colônias. O produto de PCR para os primers de triagem, ABglmS2 forward new e Tn7 reverse é de 382 pares de base.
Os controles negativos para a reação incluem selvagem tipo A.baumannii ATCC 17978, AB 258, e nenhum modelo.
