Para começar, pipete três microlitros de anticorpo H3K4me1 em um tubo contendo 150 microlitros de tampão de anticorpo. Pipetar o anticorpo diluído em cada tubo de uma tira de oito tubos de PCR contendo mioblastos de ratinho sequestrados em esferas de Concanavalina A. Inverta os tubos várias vezes para misturar bem o conteúdo.
Em seguida, coloque os tubos durante a noite em um agitador de movimento de gangorra a quatro graus Celsius. No dia seguinte, depois de clarificar as amostras em um rack magnético, pipetar o sobrenadante. Adicione 50 microlitros de anticorpo secundário diluído em cada tubo de amostra após aspirar o sobrenadante.
Misturar os tubos de amostra por inversão e incubar num agitador de movimento de gangorra durante uma hora à temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante da amostra clarificada. Em seguida, pipete 200 microlitros de DIG Wash Buffer em cada tubo.
Coloque os tubos de volta no rack magnético e pipete o sobrenadante. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de 300 DIG contendo pA/G-Tn5a em cada tubo. Quando a incubação estiver concluída, coloque os tubos de volta no rack magnético.
Em seguida, pipetar o sobrenadante clarificado. Agora adicione 200 microlitros de 300 DIG Buffer em cada tubo. Coloque os tubos de amostra em um agitador por três minutos em temperatura ambiente.
Após a última lavagem, pipetar completamente o sobrenadante de cada tubo clarificado magneticamente. Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de marcação. Por fim, incubar os tubos em uma máquina de PCR a 37 graus Celsius por uma hora sem usar a função de aquecimento da tampa do instrumento.
