Para começar, adicione 150 microlitros de tampão de marcação nos tubos de amostra contendo as amostras de mioblastos de camundongo marcadas. Pipete EDTA, SDS e proteinase K em cada tubo. Vortex o conteúdo dos tubos para misturar bem e, em seguida, incube os tubos a 55 graus Celsius por duas horas em uma máquina de PCR.
Em seguida, pipete cada amostra em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro contendo 200 microlitros de mistura de fenol-clorofórmio. Vortex o conteúdo dos tubos para misturá-los. Quando a centrifugação estiver concluída, transfira a camada superior para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Em seguida, adicione 200 microlitros de clorofórmio nos novos tubos antes de fazer vórtice e centrifugar novamente. Aspire a camada superior em um novo tubo. Agora adicione 550 microlitros de etanol 100% em cada tubo de amostra e misture bem invertendo.
Em seguida, coloque os tubos a menos 80 graus Celsius por uma hora para induzir a precipitação do DNA. Centrifugue a solução na velocidade máxima por 15 minutos para obter um pellet de DNA. Depois de despejar o sobrenadante, lave o pellet com etanol 75% antes de centrifugar novamente por cinco minutos.
Em seguida, ressuspenda o pellet em 21 microlitros de água bidestilada Configure o PCR a ser usado para a preparação da biblioteca. Use um primer N7XX Illumina diferente para cada amostra e um primer N5XX universal.
Insira o número do ciclo de PCR no instrumento para executar o PCR. Após a amplificação, eletroforese três microlitros das bibliotecas em géis de agarose. As bibliotecas CUT&Tag continham principalmente mononucleossomos marcados de cerca de 300 pares de bases.
qPCR mostrou que a marca H3K4me1 foi altamente enriquecida nas regiões intensificadoras do gene MYOD1.
