Depois de cultivar Aspergillus flavus NRRL 3357 aflatoxigênico em uma inclinação de trado de dextrose de batata por seis dias a 30 graus Celsius, eluir os esporos do fungo do tubo de ensaio com 10 mililitros de água contendo Tween 20. Vortex o tubo de ensaio por 20 segundos. Filtrar a suspensão de esporos de fungos através de lã de vidro colocada num funil e utilizar o filtrado em vórtice para diluição.
Diluir uma alíquota de 100 microlitros da suspensão filtrada com 9,9 mililitros de água. Após o vórtice, conte os esporos com um hemocitômetro. Usando a fórmula na tela, calcule o volume de água necessário para diluir um volume da suspensão original da inclinação para 1000 esporos por microlitro.
Adicione um volume da suspensão original à quantidade calculada de água. Em seguida, quebre suavemente as vagens de amendoim e remova as cascas. Coloque as sementes em um béquer estéril.
Adicione a solução de peróxido de hidrogênio a 0,05% até que o béquer esteja 70% cheio, permitindo que as sementes absorvam água por três horas. Transvase a solução de peróxido de hidrogênio das sementes e adicione aproximadamente três vezes a quantidade de mistura de água com 80% de etanol para cobrir as sementes. Incube por um minuto.
Em seguida, enxágue as sementes duas vezes com volumes iguais de água destilada estéril. Adicionar o volume quíntuplo da solução de peróxido de hidrogénio a 3% ao copo e deixar repousar durante cinco minutos. Após a decantação da solução de peróxido de hidrogênio, enxágue as sementes duas vezes com volumes iguais de água estéril.
Coloque um papel de filtro de 90 milímetros de diâmetro na tampa e umedeça o papel com um mililitro de água estéril. Coloque a tampa no prato. Coloque as sementes em uma toalha de papel estéril.
Usando uma pinça, remova a casca da semente. Coloque as sementes sem pele imediatamente na placa de Petri para evitar a desidratação. Corte cerca de um terço da semente que contém o eixo embrionário.
Divida a semente em cotilédones e, usando uma broca afiada, perfure aproximadamente 1,5 a dois milímetros de profundidade no meio do lado externo de cada cotilédone. Coloque quatro a seis pedaços perfurados das sementes em uma travessa de 1,5%. Usando uma pipeta de 10 microlitros, adicione dois microlitros da suspensão de esporos na cavidade perfurada de cada meio cotilédone.
Depois de cobrir o prato com uma tampa, incube a 30 graus Celsius sem luz por 72 horas.
