Após a incubação das sementes de amendoim, após a inoculação de esporos de Aspergillus flavus, use uma pinça para remover os pedaços de sementes do ágar. Coloque os pedaços de sementes em frascos de contas de sete mililitros rotulados contendo 13 contas de cerâmica de zircônio. Para a extração de fitoalexinas e aflatoxinas, dependendo do tamanho da semente, adicione dois ou quatro mililitros de uma mistura de água com metanol ao frasco de esferas e pulverize a 5,5 metros por segundo por 45 segundos.
Em seguida, centrifugar a 1 860 x g durante três minutos e recolher o sobrenadante num frasco novo. Para análise de aflatoxinas, usando uma haste de vidro, cortada em um ângulo de 90 graus, insira uma frita porosa de polietileno em uma coluna de polipropileno de 1,5 mililitro. Com uma colher personalizada, adicione 50 miligramas de sílica gel de magnésio na coluna.
Cubra a coluna com uma frita idêntica e empurre-a para baixo com uma haste de vidro. Adicione 0,5 mililitros de sobrenadante na mini coluna embalada personalizada e deixe o extrato escorrer por gravidade para um frasco de vidro de quatro mililitros. Adicione um mililitro de mistura de água com metanol na coluna para lavar as impurezas por gravidade no mesmo frasco.
Depois de descartar os eluatos combinados do frasco, adicione 1,2 mililitros de acetona acetil nitrila água, 88% de mistura de ácido fórmico na coluna para eluir a fração de aflatoxina em um frasco de vidro limpo. Evapora o solvente do frasco em uma corrente de nitrogênio em um bloco de aquecimento a 45 graus Celsius. Após a evaporação, tampe o frasco e resfrie-o em cubos triturados por um minuto.
Coloque os filtros de pipeta Pasteur personalizados em tubos de ensaio descartáveis e coloque-os no gelo para minimizar a evaporação durante a filtração. Dissolva o resíduo seco na medida precisa de 0,25 a 1,0 mililitro da mistura de água com metanol. Após o vórtice, transfira uma alíquota de 0,2 mililitros para o filtro.
Use gás nitrogênio para agilizar a filtração em um frasco de amostrador automático de 400 microlitros. Coloque o frasco no amostrador automático UPLC e ajuste o volume de injeção para 0,1 a 3,0 microlitros. Para a fitoalexina, transfira 200 microlitros de sobrenadante do frasco da centrífuga de sete mililitros para um filtro de pipeta Pasteur.
Após a filtração, coloque uma tampa correspondente com septo de politetrafluoretileno no frasco para injetáveis. Para separações de aflatoxinas, implemente um gradiente usando água, metanol e acetil nitrilo com composições percentuais e tempos de execução específicos. Defina a taxa de fluxo para 0,45 mililitros por minuto e o tempo de execução para 9,5 minutos.
No aquecedor de coluna do sistema, defina a temperatura da coluna para 40 graus Celsius. Para quantificar as aflatoxinas, defina os comprimentos de onda de excitação e emissão para 362 e 440 nanômetros, respectivamente. Em seguida, usando o método da curva de calibração e o manual do software UPCL, execute a análise para determinar as concentrações de aflatoxina nas amostras de teste.
Para a separação de estilbenóides, use um gradiente composto por água, metanol e ácido fórmico a 88% com condições e tempos percentuais específicos. Defina a taxa de fluxo para 0,5 mililitros por minuto e o tempo de execução para 12 minutos. Determinar, utilizando o método da curva de calibração, as concentrações de estilbenóides e comparar as áreas dos picos da amostra de ensaio com os padrões puros e autênticos.
O método de quantificação de aflatoxina baseado em UPLC atinge uma quantificação sensível da aflatoxina B1 com um limite de dois picogramas por injeção. O extrato purificado de sementes colhidas de uma espécie selvagem de Areca apresentou quantificação inequívoca de aflatoxinas. A abordagem da coluna de sílica gel de magnésio remove efetivamente as impurezas da fração de aflatoxina e demonstra alta eficiência de quantificação em contraste com os métodos anteriores.
Além disso, este método também auxilia na quantificação de fitoalexinas de amendoim.
