Para começar, adicione corante laranja 500x a uma solução PBS para obter diferentes proporções de corante, inicie o software de aquisição de dados na área de trabalho. Clique em Instrumento, escolha o modelo de microplaca correspondente e selecione OK. Clique nas configurações de aquisição e escolha Fluorescência.
Na interface de comprimento de onda, defina o lambda um para 470 nanômetros e 570 nanômetros e pressione OK. Pipete 100 microlitros de cada concentração do corante laranja nos poços de uma placa de 96 poços. Coloque a placa no estágio de detecção do instrumento leitor de microplacas fluorescentes.
Clique no ícone Ler no software e meça a fluorescência de cada concentração de corante 13 vezes à temperatura ambiente com um intervalo de dois minutos. Após cada determinação, clique no ícone Exportar e selecione Exportar para XML XLS TXT. Escolha Todas as placas.
Em seguida, selecione Placa no formato de saída e clique em OK para salvar os dados no formato XLS para análise posterior. Agora, ligue o banho seco de agitação de aquecimento digital. Defina a temperatura de aquecimento para 35 graus Celsius e o tempo de aquecimento para dois minutos.
Prepare a proporção ideal de diluição do corante em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, coloque-o no banho seco de aquecimento digital por dois minutos. Agora, adicione 100 microlitros de PBS e as soluções de coloração aos poços da placa.
Coloque a placa no estágio de detecção do instrumento. Clique no ícone Ler no software de aquisição de dados. Defina a temperatura de aquecimento para 40 graus Celsius e o tempo de aquecimento para dois minutos.
Agora, pipete a solução de corante na placa de volta para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Aqueça-o no banho seco de aquecimento digital por dois minutos. Repita a adição das soluções de corante, exportando os dados resultantes para testar a absorbância da solução de corante em incrementos de temperatura de cinco graus de 35 a 95 graus Celsius.
Combine a solução de proteína CD40 com PBS para obter concentrações finais de 5, 10, 15 e 20 microgramas por microlitros. Em seguida, combine o corante laranja com PBS para obter uma concentração final de um é para 500. Avalie a absorbância da solução de proteína CD40 em incrementos de temperatura de cinco graus de 35 a 95 graus Celsius.
Salve os dados como arquivos XLS e, em seguida, calcule o ponto de fusão ou o valor TM usando o software de análise de dados. Em seguida, misture CD40 e umbeliferona na solução PBS. Em seguida, pipete o corante laranja no PBS para obter uma concentração de solução de um é para 500.
Meça a absorbância da solução de complexos de umbeliferona CD40 em incrementos de temperatura de cinco graus de 35 a 95 graus Celsius. O corante laranja exibiu consistentemente excitação de fluorescência estável tanto à temperatura ambiente quanto a temperaturas elevadas. Uma razão de diluição ideal de um é para 500, foi determinada.
Um valor de TM estável de 51,82 graus Celsius foi detectável em uma concentração de 15 microgramas por mililitros, que diminuiu para 45,79 graus Celsius com um aumento na concentração de proteína CD40.
