Para começar, solte o camundongo injetado com corante azul de bromofenol da estrutura estereotáxica. Após a anestesia, prenda o mouse em uma placa de espuma com fita adesiva. Faça uma incisão de um a dois milímetros no apêndice atrial direito.
Insira uma agulha de perfusão no ventrículo esquerdo. Infundido 20 mililitros de solução salina pré-resfriada, seguidos por 20 mililitros de solução gelada de paraformaldeído a 4%. Agora faça uma incisão ao longo da linha média do pescoço ao nariz para remover a pele e expor o crânio.
Use uma pinça ou tesoura para limpar o músculo residual do crânio. Coloque a ponta de uma lâmina da tesoura fina entre o forame magno e o cérebro com uma borda afiada voltada para o osso na extremidade rostral da sutura sagital mediana. Deslize suavemente e corte o crânio ao longo da sutura sagital mediana.
Use uma pinça para remover o crânio, expondo o cérebro. Depois de ligar o criostato do micrótomo rotativo, ajuste a temperatura da câmara para menos 20 graus Celsius. Despeje um pouco de temperatura de corte óptico, ou composto OCT, para cobrir a superfície do disco de amostra uniformemente.
Coloque o disco de amostra na câmara criogênica e deixe o OCT solidificar. Fixe o disco à cabeça da amostra. Em seguida, aproxime a lâmina do bloco e apare o bloco OCT para fazer um plano plano paralelo ao disco.
Usando uma lâmina de barbear, corte o cérebro na direção coronal, longe do local da injeção, em um molde de fatia de cérebro. Colocar o tecido cerebral que contém o local da injeção, com o lado cortado virado para baixo, no plano plano da OCT. Despeje OCT no cérebro e coloque o disco na câmara criogênica, permitindo que o bloco de amostra se solidifique.
Apare o bloco de amostras até que a região alvo se aproxime e faça várias seções a partir do nível do local de injeção. Use um pequeno pincel de escrita resfriado para coletar as fatias do cérebro coronal em uma placa de seis poços contendo PBS em temperatura ambiente. Usando um pincel, pegue as seções cerebrais da placa de seis poços e coloque-as em uma lâmina.
Após a secagem, visualmente, observe a região injetada nas seções cerebrais.
