Para começar, selecione um meio de crescimento de nematóides ou placa NGM ocupada por larvas de Caenorhabditis elegans famintas no estágio L1. Usando um mililitro de água estéril, lave as minhocas do prato com cuidado. Alíquota de aproximadamente 300 microlitros da população de minhocas em placas NGM semeadas com OP50 concentrado.
Deixe as placas secarem usando um secador de placas ou um bico de Bunsen e, em seguida, incube a 20 graus Celsius até que uma população significativa se torne adulta grávida. Para coletar os vermes, lave-os da placa com até 10 mililitros de água estéril e transfira uma mistura de água morna para um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe os vermes assentarem por gravidade no fundo do tubo por aproximadamente quatro minutos.
Usando uma pequena ponta de pipeta, aspire cuidadosamente e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione até 15 mililitros de água estéril. Após a lavagem final, remova o sobrenadante e adicione cinco mililitros de uma solução recém-preparada de alvejante e hidróxido de sódio.
Incube os vermes por cinco minutos em temperatura ambiente enquanto vórtice a cada minuto por pelo menos 10 segundos. Monitore o progresso usando um microscópio de dissecação. Assim que todos os adultos se abrirem ou se dissolverem, adicione tampão M9 para neutralizar a reação, elevando o volume final para 15 mililitros.
Em seguida, centrifugue o tubo por dois minutos a 1.300 G.Lave os ovos mais duas vezes com 13 mililitros de tampão M9 por centrifugação, seguida de uma única lavagem com 15 mililitros de tampão S completo. Em seguida, centrifugue os ovos por dois minutos a 1.300 G.Após centrifugação, aspire o sobrenadante e adicione 10 mililitros de tampão S completo. Gire o tubo suavemente à temperatura ambiente durante a noite usando um mutador ou um dispositivo semelhante.
Usando um microscópio de dissecação, avalie se os vermes eclodiram. Conte os vermes em gotas de 10 microlitros de tampão S ao microscópio. Prepare uma mistura líquida de vermes com 60 vermes por mililitro em meio completo S contendo carbenicilina, anfotericina B e OP50.
Adicione 120 microlitros de meio com minhocas nas fileiras A a G e sem minhocas no meio na fileira H. Em seguida, sele a placa com um selador de fita para evitar contaminação e evaporação. Incubar as placas seladas por aproximadamente 65 horas a 20 graus Celsius até que os animais se tornem vermes L4. Adicione 30 microlitros de uma solução estoque de fluorodesoxiuridina 0,6 milimolar a cada poço para esterilizar os animais no estágio L4.
Sele novamente a placa usando seladores de fita e agite-a por 20 minutos a 800 RPM em um agitador de placa de microtitulação. Devolva as placas para a incubadora de 20 graus Celsius. No dia seguinte, adicione a droga de interesse à cultura do primeiro dia.
Feche novamente as placas com selador de fita e agite por 20 minutos a 800 RPM em um agitador de placas. Depois de remover a tampa e o selo, meça o OD600 em um leitor de placas para a medição do primeiro dia. Feche novamente e devolva as placas a uma incubadora de 20 graus Celsius.
Usando um microscópio invertido, de preferência com uma objetiva de duas vezes, conte a população de vermes em cada poço e registre os números em uma planilha. Após a contagem, devolva as placas à incubadora de 20 graus Celsius. A curva de resposta à dose é uma mudança completa na ingestão de alimentos em função da concentração de serotonina mostrou que a cepa N2 pode comer demais de maneira dependente da dose.
O mutante daf-16 mu86 exibe maior alimentação basal do que N2. No entanto, não pode responder à serotonina da mesma maneira dose-dependente que a cepa N2. Uma diferença significativa foi observada na ingestão de alimentos de vermes tratados com loxapina, mas alimentados com bactérias mortas por raios-x, raios gama ou paraformaldeído. A comparação da ingestão alimentar de uma série de cepas genéticas mostrou que os mutantes exc-4 e cgr-1 comem menos, enquanto os mutantes srp-6 comem mais.
