Para começar, rotule os tubos de microcentrífuga de dois mililitros. Pipetar alíquotas de 50 microlitros de culturas de E.coli DnaK756 para dentro dos tubos. Coloque os tubos sobre o gelo.
Adicionar 10 a 50 nanogramas de DNA plasmidial em cada tubo separado com as alíquotas de E.coli. Mantenha os tubos no gelo por 30 minutos. Em seguida, coloque as células a 42 graus Celsius por 60 segundos para aquecer as células.
Devolva os tubos ao gelo por 10 minutos. Pipetar 950 microlitros de caldo de triptona fresco duas vezes para dentro dos tubos e, em seguida, incubar os tubos em um agitador a 37 graus Celsius. Pipetar 100 microlitros da cultura celular transformada e espalhar em placas de ágar com duas vezes triptona de levedura contendo antibióticos.
Centrifugar o resto das células durante um minuto a 5.000 G a quatro graus Celsius. Decantar cerca de 800 microlitros do caldo. Ressuspender as células peletizadas no meio restante.
Coloque as células recuperadas em uma placa de ágar triptona duas vezes levedura e, em seguida, incube ambas as placas de ágar a 37 graus Celsius durante a noite. Para plaquear as células, use um laço estéril para pegar uma única colônia dos transformadores. Inocular em 10 mililitros de duas vezes o caldo de triptona de levedura, suplementado com antibióticos.
Agora, prepare diluições seriadas das células de 100 a 10 até o quinto negativo em tubos de microcentrífuga de dois mililitros. Antes de detectar as células, coloque placas de ágar suplementadas com antibióticos e IPTG em um forno a 40 graus Celsius com suas tampas parcialmente abertas. Quando as placas estiverem secas o suficiente, identifique dois microlitros das células diluídas em série nas placas de ágar.
Coloque cada amostra em duas placas separadas. Incubar uma placa à temperatura de crescimento permissiva de 37 graus Celsius e a outra à temperatura de crescimento não permissiva de 43,5 graus Celsius. Para confirmar a expressão de proteínas recombinantes, use uma alça estéril para pegar parte das células restantes da mesma colônia de transformantes.
Inocular as células em 10 mililitros de fermento antibiótico suplementado com caldo de triptona. Incube as culturas em um agitador durante a noite a 37 graus Celsius. Todas as células de E.coli DnaK756 cresceram à temperatura de crescimento permissiva de 37 graus Celsius.
No entanto, apenas células heterólogas expressando DnaK e KPf cresceram na temperatura de crescimento não permissiva. As células mutantes que expressam KPf-V436F só cresceram a 37 graus Celsius, mas não conseguiram crescer a 43,5 graus Celsius.
