Para começar, pipetar 80 microlitros de células de E.coli transformadas em um frasco. Pipetar 20 microlitros de quatro vezes o tampão de carregamento Laemmli SDS para o frasco para injetáveis. Ferva a suspensão a 100 graus Celsius por 10 minutos em um bloco de aquecimento.
Em seguida, carregue 10 microlitros da amostra em um gel pré-moldado SDS. Eletroforese o gel à temperatura ambiente por uma hora a 120 volts em tampão de funcionamento SDS. Quando a eletroforese estiver completa, core o gel na coloração de Coomassie por uma hora.
Desestabilizar o gel num tampão de coloração contendo 50% de metanol e 10% de ácido acético em água destilada durante duas horas. Coloque o gel em um sistema de imagem em gel para visualizar as bandas de proteínas. Em seguida, transfira as proteínas do gel SDS para uma membrana de nitrocelulose.
Lave a membrana de nitrocelulose três vezes em tampão de lavagem. Transfira a membrana para 5% de leite desnatado contendo anticorpos diluídos em uma proporção de um para 2.000. Incubar a membrana com os anticorpos a quatro graus Celsius enquanto agita a 60 RPM durante uma hora.
Em seguida, lave a membrana de nitrocelulose em tampão de interpolação TBS três vezes por 15 minutos cada para remover qualquer anticorpo não especificamente ligado. Agora transfira a membrana para um prato com o anticorpo secundário. Incubar a membrana a quatro graus Celsius enquanto agita a 60 RPM durante uma hora.
Depois de lavar a membrana como antes, use um reagente de detecção de quimioluminescência aprimorado para resolver as bandas. Visualize as bandas usando um imageador de gel.
