Para começar, remova as esferas magnéticas de purificação de DNA da geladeira de dois a oito graus Celsius. Centrifugue as esferas por 10 segundos a 2.500G após a mistura. Transfira o produto de reação ligado ao adaptador para um tubo de microcentrífuga de baixa absorção de 1,5 mililitro.
Adicione 45 microlitros de esferas magnéticas purificadas de DNA a cada tubo. Depois de agitar os componentes, centrifugue o tubo por 10 segundos e, em seguida, coloque-o em um rack magnético por três minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem pipetar as contas.
Agora transfira 300 microlitros de etanol 75% recém-preparado para cada tubo de microcentrífuga. Gire suavemente os tubos quatro vezes a 180 graus. Assim que a solução clarear, descarte imediatamente o sobrenadante, evitando pipetar os grânulos.
Em seguida, centrifugue os tubos brevemente após removê-los do suporte magnético. Coloque os tubos no suporte magnético e pipete qualquer líquido restante. Abra as tampas dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro e deixe os grânulos secarem em temperatura ambiente por cinco minutos.
Depois de descongelar e agitar os reagentes relacionados à PCR, centrifugue os reagentes por 10 segundos. Remova o tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro do suporte magnético e adicione reagentes de PCR. Centrifugue o tubo de vórtice brevemente para evitar gotas de líquido na parede e na tampa do tubo.
Em seguida, transfira o produto de PCR para um novo tubo de PCR. Incube em um termociclador e execute o programa de amplificação para amostras de DNA e CDNA. Após a incubação, centrifugue o tubo de PCR por 10 segundos e transfira o produto para um novo tubo de microcentrífuga de baixa absorção de 1,5 mililitro.
Adicione 25 microlitros de esferas magnéticas purificadas de DNA a cada tubo e misture bem por vórtice. Centrifugue o tubo em baixa velocidade e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, coloque os tubos em um rack magnético por três minutos até que a solução desapareça.
Transfira o sobrenadante para novos tubos de microcentrífuga, evitando pipetar os grânulos. Transfira 300 microlitros de etanol a 75% recém-preparado para os tubos e lave as esferas duas vezes usando um rack magnético, conforme demonstrado anteriormente. Depois de centrifugar os tubos brevemente, coloque-os na prateleira e pipete qualquer líquido restante.
Abra as tampas dos tubos de 1,5 mililitro e seque as contas em temperatura ambiente por cinco minutos. Pipete 50 microlitros de eluente nos tubos. Realize uma breve centrifugação após o vórtice dos tubos.
Coloque os tubos em um rack magnético por três minutos até que a solução fique clara. Transfira cuidadosamente o líquido para um novo tubo e rotule-o com o nome da biblioteca.
