Para começar, coloque o rato em decúbito dorsal eutanasiado na placa de dissecação. Usando pinos T de dissecação, prenda as almofadas do mouse à placa. Com uma tesoura de dissecção cirúrgica, faça uma incisão na parte inferior do abdômen e corte até o queixo.
Depois de separar a pele do revestimento peritoneal, estique-a perpendicularmente para longe do tronco e prenda-a. Empregando pinças rombas, remova cuidadosamente os linfonodos cervicais, axiais, braquiais e inguinais, bem como o baço e coloque-os em um filtro de células de 70 micrômetros contendo dois mililitros de meio R9. Para preparar uma suspensão de célula única, gire a ferramenta de ruptura de tecido meia volta no sentido horário e anti-horário repetidamente.
Lave o filtro com cinco mililitros de mídia. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue-o. Após a decantação do sobrenadante, adicione 500 microlitros de tampão de lise ao tubo para remover os glóbulos vermelhos.
Após um minuto, misture as células com 9,5 mililitros de meio R9. Centrifugue o tubo. E decantar bem o sobrenadante.
Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio de seleção negativa contendo anticorpos anti-MHC2 e anti-CD4 e coloque o tubo em um balancim por 30 minutos. Depois de peletizar as células a 270G por cinco minutos, decantar o sobrenadante. Simultaneamente, em um tubo cônico de 15 mililitros, lave 200 microlitros de grânulos de ovelha anti-rato e imunoglobulina G em sete mililitros por meio.
Coloque o tubo em um ímã e remova o meio. Depois de lavar mais duas vezes, ressuspenda as contas em sete mililitros de meio R9. Em seguida, misture sete mililitros da suspensão do grânulo com o pellet celular e incube o tubo em um balancim.
Para remover as células ligadas ao cordão de anticorpos, coloque o tubo cônico diretamente no ímã por três minutos. Aspire a suspensão da célula em um novo tubo de 15 mililitros, mantendo o tubo no ímã. Pellet as células CD8 positivas enriquecidas e lave três vezes em meio.
