Para começar, realize imagens de lapso de tempo de linfócitos T vivos isolados de tecidos linfóides secundários murinos. Para análise de migração de células T, abra o software Velocity e crie uma nova sequência de imagens. Selecione e mova filmes de microscopia de vídeo com lapso de todos os tempos para a área azul no Velocity.
Utilizando a ferramenta de aprimoramento de contraste, modifique o brilho e o contraste e, em seguida, ajuste os tamanhos da imagem para 0,325 micrômetros para 20x e 0,65 micrômetros para ampliação de 10x. Depois de configurar a sequência para definir os pontos de tempo, vá para a guia de medição e desmarque todos os pontos de tempo. Em seguida, encontre objetos usando intensidade e deslize a barra para a direita do pico.
Para evitar detritos celulares, exclua todas as células menores que 10 micrômetros e maiores que 100 micrômetros de diâmetro. Marque ignorar objetos estáticos seguido de unir automaticamente faixas quebradas. Para salvar um novo protocolo, vá para medições.
Clique em salvar protocolo, seguido do nome novo protocolo. Na guia de medição, clique em medir todos os pontos de tempo e classifique as faixas por intervalo de tempo, de alto a baixo. Depois de registrar os números de identificação das faixas para as células com boas trilhas, exporte o arquivo como texto separado por vírgulas e transfira os dados para o software de análise desejado.
Para realizar o rastreamento manual, abra a imagem J, vá para plug-ins e selecione rastreamento e rastreamento manual. Defina os intervalos de tempo X por calibração Y, tamanho do pixel e calibração Z. Em seguida, clique em adicionar faixa para iniciar o rastreamento de células individuais.
Selecione uma célula no primeiro ponto de tempo e continue-a em todos os pontos de tempo. Por fim, clique em faixa final. O rastreamento celular assistido por software caracterizou comportamentos migratórios de células T individuais ativadas, conforme denotado pelas linhas de cores diferentes.
