Comece realizando o ensaio MM QPCR para medição do comprimento dos telômeros. Em seguida, abra o software e selecione o recurso de configuração da placa. Depois disso, escolha a opção de visualização ou edição de placa no menu suspenso.
Agora destaque todos os poços no prato. Clique em selecionar floraforos. Marque a caixa rotulada cyber, e certifique-se de que todas as outras caixas estão desmarcadas.
Em seguida, clique em OK para confirmar. Mantendo o destaque em todos os poços, localize e marque a caixa ao lado de cyber, ao lado da palavra load para rotular todos os poços com cyber. Agora destaque os três poços de controle sem modelo posicionados na parte superior ou inferior da diluição serial de controle padrão.
Em seguida, no menu de tipo de exemplo à direita, selecione NTC. Destaque os 21 poços que compõem a diluição serial de controle padrão e escolha padrão no menu de tipo de amostra. Enquanto esses poços ainda estiverem selecionados, clique em replicação técnica, no menu de tamanho de replicação, escolha três.
Em seguida, selecione horizontal e clique em aplicar. Depois disso, role para baixo até a seção da série de diluição e insira dois no campo do fator de diluição. Para a placa P1, insira duas vezes 10 elevado a menos três no campo de concentração inicial.
Em seguida, marque a caixa para diminuir e clique em aplicar para confirmar as configurações. Para a placa P2, insira 3,13 vezes 10 elevado a menos cinco no campo de concentração inicial. Certifique-se de marcar a caixa para aumentar e selecione aplicar para finalizar a configuração.
Agora realce as colunas correspondentes à tira de PCR A no menu do tipo de amostra, escolha desconhecido e prossiga para selecionar replicação técnica. No menu de tamanho de replicação, escolha três e opte por horizontal antes de clicar em aplicar. Clique em OK no canto inferior direito da janela do editor de placas.
Confirme as alterações clicando em sim quando solicitado. Em seguida, verifique se as curvas na guia de quantificação parecem apropriadas para a etapa nove e a etapa 12 e se os valores de eficiência entre essas duas etapas não divergem em mais de 10%Para P1, selecione a etapa nove e destaque os 21 poços correspondentes à curva padrão. Copie os valores CQ do canto inferior direito da janela do software.
Em seguida, abra o modelo de folha de dados do telômero e cole esses valores na coluna padrão de uma folha B. Depois, insira o valor da inclinação da etapa nove na célula C quatro na folha padrão, verifique se o coeficiente de variação para cada triplicado de diluição padrão está abaixo de 0,1. No CFX, exclua quaisquer pontos de dados discrepantes da análise que façam com que um conjunto de triplicatas fique fora do intervalo. Agora, confirme se apenas os 72 poços de amostra no arquivo de análise P1 estão destacados em azul na guia de quantificação.
Em seguida, na etapa nove, copie os valores CQ e SQ encontrados no canto inferior direito da janela do software e cole-os na folha P1 de amostras começando na célula D3. Usando o CFX maestro, certifique-se de que todos os valores de CQ para amostras analíticas estejam dentro da faixa dos valores de CQ mais baixos e mais altos da curva padrão. Na planilha Excel, verifique se a concentração inicial no NTC é inferior a 5% da quantidade média de DNA nos poços de amostra. Para o controlo da qualidade ao nível da amostra, examinar os desvios-padrão e o coeficiente de variação nas colunas J e K nas folhas P1 e P2 das amostras.
Verifique se os VCs entre placas de amostra individuais na folha P1 versus P2, especificamente na coluna G, não excedem 0,05. Se o CV interplacas de uma amostra for maior do que o aceitável, remova até um triplicado do cálculo para cada amostra. Para controle de qualidade no nível da placa, verifique se a variação média entre placas em todas as amostras em cada placa é inferior a 0,05.
Se o CV interplacas de uma amostra for maior do que o aceitável, remova até um triplicado do cálculo para cada amostra. Para controle de qualidade adicional do nível da placa, verifique se a variação geral entre placas na folha P1 versus P2 é inferior a 0,06.
