Comece transfectando células T HEK 293. Três dias após a transfecção, remova o meio dos poços e lave uma vez com PBS. Adicione 500 microlitros de tripsina a cada poço.
Incube por cinco minutos a 37 graus Celsius para separar todas as células da placa. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio DMEM completo a cada poço e ressuspenda as células. Transfira todas as células de cada poço para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro.
Em seguida, centrifugar durante dois minutos a 1 000 g à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante pipetando e lave o pellet uma vez com um mililitro de PBS. Novamente, remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células em 500 microlitros de PBS.
Transfira as células para tubos FACS. Analise as células usando um citômetro de fluxo. Carregue a suspensão celular não ressecada.
Na planilha de citometria de fluxo, pressione Adquirir e ajuste as tensões de dispersão direta e lateral. Para posicionar as células na região do meio, gate em torno dessa população R1 para excluir os detritos no quadrante inferior esquerdo. Altere a porta de FL1, FL2 dot blot como G R1. Selecione a ferramenta de controle quádruplo e clique no extremo superior direito da população de células no ponto FL1/FL2 como G R1. Ajuste as tensões FL1/FL2 para posicionar as células no quadrante inferior esquerdo.
Pressione Pausar e abortar. Em seguida, carregue as células de controle GFP de cor única. Pressione Adquirir e ajuste a compensação para posicionar as células positivas GFP no quadrante inferior direito.
Pressione Pausar e abortar. Em seguida, carregue as células de controle de cor única mCherry. Pressione Adquirir e ajuste a compensação para posicionar as células positivas mCherry no quadrante superior esquerdo.
Pressione Pausar e abortar. Clique em Adquirir na barra de menus e selecione Armazenamento de aquisição. Em critérios de coleta, selecione A aquisição será interrompida quando 10.000 eventos G1 R1 forem contados.
Cancele a marca de seleção de Configuração. Carregue as células de amostra. Pressione Adquirir e aguarde até que 10.000 células G1 R1 tenham sido contadas.
Repita o mesmo para outras amostras e controles.
