Para começar, importe todos os arquivos de fax para o painel de análise. Abra um dos arquivos para visualizar o gráfico de dispersão do lado da dispersão direta. Construa uma porta poligonal para isolar as células intactas, evitando detritos no canto inferior esquerdo do gráfico.
Rotule a subpopulação como células intactas e arraste essa porta para a barra de todas as amostras. Verifique o gating para cada exemplo usando o botão de próximo exemplo. Clique duas vezes na subpopulação de células intactas da amostra de controle negativo para abrir um novo gráfico.
Ajuste o eixo de plotagem para FL1-H no eixo X para representar GFP e FL2-H no eixo Y representando mCherry. Em seguida, selecione a ferramenta quad gating e clique no extremo superior direito da população de células negativas. Arraste os quatro portões retangulares para a barra de células intactas.
Examine cada amostra de controles de cor única GFP ou mCherry para obter o gating correto usando o próximo botão de amostra. Navegue até o editor de layout. Aqui, selecione plotagens representativas e escolha copiar para o editor de layout.
Selecione todos os gráficos representativos e clique duas vezes para abrir a definição do gráfico. Nomeie o rótulo do eixo X como GFP e o rótulo do eixo Y como mCherry. Determine a eficiência relativa do reparo do DNA comparando o número de células positivas para GFP com o número de células positivas para mCherry dentro do mesmo gráfico.
Uma estratégia adequada de ajuste e controle de remuneração foi implementada para garantir a precisão da análise de NHEJ e HR. Essa estratégia posicionou as células GFP positivas no quadrante inferior direito e as células mCherry positivas no quadrante superior esquerdo. A porcentagem de células positivas para GFP indicou reparo de DNA DSB e eficiência de transfecção.
Por outro lado, a porcentagem de células positivas para mCherry refletiu apenas a eficiência da transfecção. A eficiência de reparo do DNA DSB foi calculada como a proporção de células positivas para GFP positivas para mCherry. Além disso, o papel da proteína da síndrome de Wiskott-Aldrich e da proteína SCAR Humalog ou WASH no reparo do DNA foi demonstrado usando o ensaio NHEJ em células shCONTROL e shWASH.
A perda de WASH diminuiu a eficiência do NHEJ, ressaltando seu papel na promoção do NHEJ.
