Construção em larga escala de plasmídeos UAS-cDNA/ORF por montagem modular baseada em CRISPR (CRISPRmass)

Para realizar as reações paralelas do tubo de ensaio de duas etapas do conjunto modular baseado em CRISPR ou CRISPRmass, prossiga para clivar os esqueletos vetoriais idênticos dos plasmídeos cDNA / ORF pelo Cas9 sgRNA na etapa de reação do tubo de ensaio um. Para fazer isso, organize os tubos de 0,2 mililitro devidamente rotulados em um bloco de resfriamento de alumínio no gelo. Prepare a mistura principal para o número N de reações misturando quantidades apropriadas de Cas9, sgRNA, tampão Cas9 e água tratada com DEPC.

Uma vez que os componentes da mistura principal são adicionados, vórtice o mesmo para garantir a mistura adequada. Em seguida, gire a mistura e alicote dois microlitros da mistura principal para cada tubo de 0,2 mililitro. Em seguida, adicione 0,4 microlitros de plasmídeo cDNA/ORF 0,019 micromolar a cada tubo.

Incube reações de clivagem a 37 graus Celsius por uma hora. Na reação do tubo de ensaio a seguir, etapa dois, prossiga para inserir um módulo UAS específico do vetor nos plasmídeos de cDNA/ORF linearizados Cas9 resultantes. Para configurar a reação de etapa única de 1,4 microlitro para cada amostra, organize os tubos de 0,2 mililitro rotulados em um bloco de resfriamento de alumínio no gelo.

Prepare a mistura principal para N número de reações misturando quantidades apropriadas de módulo UAS e mistura mestre de montagem de reação de etapa única. Vortex a mistura bem antes de girá-la para baixo. Em seguida, alíquota de 0,77 microlitros da mistura master para cada tubo.

Adicione 0,7 microlitros de plasmídeo cDNA/ORF linearizado Cas9 à alíquota em cada tubo e incube reações a 50 graus Celsius por uma hora.