Para começar, obtenha células THP-1 diferenciadas e remova o meio gasto dos poços da placa de cultura Depois de lavar as células com PBS, adicione meio sem soro contendo lipopolissacarídeo, ou LPS, às células e incube a placa. Em seguida, adicione a solução de estoque de trifosfato de adenosina ou ATP ao grupo modelo e incube a placa por 45 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, aspire todo o sobrenadante dos poços da placa de cultura.
Depois de lavar as células duas vezes com PBS, adicione 500 microlitros de 0,05% de tripsina sem EDTA a cada poço e incube por 30 segundos. Para interromper o descolamento celular, adicione um mililitro de meio RPMI 1640 e transfira as células para um tubo de cinco mililitros. Centrifugar o tubo a 300 g durante três minutos à temperatura ambiente.
Depois de ressuspender as células em um mililitro de PBS, coloque o tubo com as células em banho-maria a 37 graus Celsius por três minutos e centrifugue. Para ressuspender as células, adicione 100 microlitros de tampão de ligação 1X e transfira as células para um novo tubo de cinco mililitros. Incubar os tubos de controle e modelo com reagentes apropriados no escuro à temperatura ambiente.
Para encerrar a incubação, adicione 400 microlitros de PBS ao tubo e agite-o suavemente. Filtrar a suspensão celular numa malha de nylon de 35 micrómetros fixada a um tubo de poliestireno de cinco mililitros, de fundo redondo. Mergulhe uma lamínula limpa em solução de alúmen de cromo por duas horas e seque-a em um forno a 37 graus Celsius.
Pelotize as células tripsinizadas conforme demonstrado anteriormente e fixe as células com 500 microlitros de fixador de microscópio eletrônico por duas horas em temperatura ambiente, seguido de incubação noturna a quatro graus Celsius. Depois de recolher as células da solução fixa, forletá-las a 300 G durante três minutos à temperatura ambiente. Adicione 100 microlitros de PBS e sopre suavemente as células.
Solte a suspensão da célula em uma lamínula e deixe repousar por cinco minutos. Aspirar todo o sobrenadante e lavar as células três vezes com PBS durante cinco minutos cada. Adicione 500 microlitros de solução de fixação de ácido 1%ósmico.
Após uma hora, aspire todo o sobrenadante. Após três lavagens de PBS, desidrate as amostras em concentrações crescentes de etanol. Ligue o secador de ponto crítico, abra o tanque de dióxido de carbono e resfrie a câmara a 10 graus Celsius.
Embrulhe rapidamente a amostra com papel de filtro e coloque-a na câmara quando a pressão da câmara for zero libras por polegada quadrada. Quando a temperatura se estabilizar em 35 graus Celsius e a pressão atingir 1.250 libras por polegada quadrada, despressurize a 100 libras por polegada quadrada por minuto. Retire a amostra quando a pressão da câmara for zero.
Finalmente, usando fita condutora, monte as amostras em microscópio eletrônico de varredura, suportes de amostra de alumínio empregando um codificador de pulverização catódica. Cubra as amostras com uma camada de ouro de dois a cinco nanômetros. A análise por citometria de fluxo mostrou que, após a estimulação com LPS/ATP, as células na região do QT aumentaram significativamente, indicando morte celular.
Micrografias eletrônicas de varredura da superfície da membrana plasmática mostraram características de piroptose, incluindo bolhas e ruptura da membrana em células estimuladas por LPS / ATP, enquanto as células de controle pareciam normais. Além disso, a estimulação com LPS/ATP levou ao aparecimento de características apoptóticas nas células, como bolhas de membrana e encolhimento celular, e foram observadas células com características de necroptose, incluindo inchaço celular e ruptura da membrana.
