Para começar, isole e canule os vasos linfáticos mesentéricos do rato eutanasiado. Pressurize os vasos linfáticos na câmara de profusão e permita que eles se equilibrem e desenvolvam contrações espontâneas estáveis. Em seguida, incubar os vasos linfáticos com éster Fura-2-acetoximetílico e ácido plurônico por 30 minutos no escuro.
Após a incubação, esvazie todo o volume do banho com vácuo de pressão negativa e encha-o novamente com a solução salina fisiológica sem reagente e com temperatura compatível três vezes. Em seguida, incube os vasos linfáticos na escuridão por mais 15 minutos para remover qualquer indicador excessivo e permitir a desesterificação. Transfira a câmara para um microscópio fluorescente invertido com luz LED, objetiva de fluor 20XS, adaptador de autoenquadramento e câmera para captura de fluorescência de 15 hertz.
Conecte o microscópio a um computador equipado com software de imagem para registrar a fluorescência e realizar a detecção de bordas. Ative a fonte de luz LED e a interface do sistema fluorescente. Agora inicie o software IonWizard.
Na guia Arquivo, selecione a opção Novo. Em seguida, vá para a guia Coletar e selecione Experimento. Carregue o modelo experimental desejado e clique em OK. Clique no botão Iniciar localizado na parte inferior da tela para iniciar o experimento.
Em seguida, ajuste os traços na tela para exibir o diâmetro do vaso, numerador, sinal 340, denominador, sinal 380 e proporção em ordem decrescente. Para modificar a escala do eixo Y para uma melhor visualização do rastreamento, vá para Rastreamentos, verifique se a opção Limites automáticos está desmarcada e selecione Editar limites do usuário. Selecione o parâmetro a ser ajustado, insira os valores mínimo e máximo para o eixo e selecione OK para confirmar.
Usando o software de detecção de bordas, ajuste a iluminação para que a parede do vaso linfático apareça como linhas escuras. Selecione uma região de interesse ou ROI livre de gordura e detritos e certifique-se de não mover esse ROI. Defina o limite de forma que a borda da parede do vaso seja detectada durante todo o ciclo de contração.
Depois de ativar o tubo fotomultiplicador, usando iluminadores LED alternam comprimentos de onda de 340 e 380 nanômetros e exposições de 50 milissegundos para excitar o Fura-2. Capture os espectros de emissão em 510 nanômetros e 15 hertz em todo o campo de imagem. Para medir a relação sinal/fundo, primeiro obtenha a fluorescência 340 e 380 com o vaso linfático no centro do campo de visão.
Em seguida, mova o campo de visão para a borda da banheira sem nenhum recipiente para capturar o fundo. Em seguida, troque a solução de banho por uma solução salina fisiológica sem reagentes e com temperatura compatível para remover o excesso do indicador Fura-2. Registre o sinal fluorescente Fura-2 basal e as contrações espontâneas por cerca de 30 minutos.
Em seguida, registre a resposta de concentração cumulativa de nifedipina e obtenha medições de fundo para cada concentração de droga. No final de cada experimento, lave os vasos linfáticos com solução salina fisiológica sem cálcio e com temperatura compatível para obter o sinal fluorescente mínimo de Fura-2 e o diâmetro máximo dos vasos linfáticos na ausência de íons de cálcio. Troque a solução do banho por uma solução salina fisiológica de temperatura adequada contendo 10 íons de cálcio milimolares e ionomicina para obter o sinal fluorescente máximo de Fura-2 e o diâmetro mínimo dos vasos linfáticos em condições de saturação de íons de cálcio.
Os parâmetros, incluindo amplitude do pico de cálcio, cálcio basal e pico de cálcio, exibiram uma redução dependente da concentração com a adição incremental de nifedipina à câmara de perfusão. Concomitantemente, parâmetros contráteis, como contração, amplitude e fluxo calculado, também demonstraram uma diminuição gradual. Os gráficos de Manhattan mostraram as respostas individuais dos vasos linfáticos para medidas de ritmicicidade, incluindo intervalo, tempo de contração e tempo de relaxamento.
