Para começar, embale a coluna FPLC e prepare o loop de amostra para carregamento de amostra. Agora vá para o software. Clique duas vezes nas configurações da bomba e selecione Loop de carga manual.
Agora conecte a tubulação da porta da coluna à tubulação na parte superior do adaptador de fluxo. Desaparafuse o tubo do laço E e coloque-o no recipiente de resíduos. Em seguida, utilizando uma seringa de 30 mililitros, retire a amostra e encaixe a seringa no adaptador da porta de injeção.
Aparafuse a seringa na porta de injeção e injete a amostra, certificando-se de que ela seja injetada visivelmente no sample loop. Agora conecte a porta de injeção com a tampa da coluna. Conecte a tubulação da parte inferior do sample loop à porta E do loop.
Em seguida, coloque a tubulação da bomba B no tampão de eluição. Navegue até a guia Início e selecione Novo método. Depois disso, selecione a guia Configurações do método na coluna da esquerda.
Vá para o menu suspenso Tipo de coluna e selecione Personalizado. Insira o volume da coluna como cinco mililitros e a vazão necessária para a corrida como um mililitro por minuto. Navegue até a seleção de unidade e selecione VC, volumes de coluna, como a unidade base do método.
Verifique se a entrada A está definida para o buffer A1 e a entrada B para o buffer B1. Em seguida, selecione a guia Estrutura de tópicos do método no menu do lado esquerdo. Em Equilíbrio, defina o volume de equilíbrio como 10 CV.Na guia Aplicativo de amostra, defina o volume de amostra observando o loop de amostra. Navegue até Column Wash e defina o volume de lavagem como cinco CV.Para Eluição, defina o volume de gradiente como 14 CV, começando de 0%buffer B a 100%buffer B.Salve o método e inicie a execução.
Certifique-se de que o coletor de frações comece na posição da primeira fração. Insira o nome da execução e clique em Iniciar. Durante a aplicação da amostra, troque os tubos que estão indo para o recipiente de resíduos por um béquer limpo.
Colete as proteínas não ligadas que fluem para fora desses tubos à medida que o fluxo passa e rotule-as como FT. Após a conclusão da execução, navegue até a guia Início e selecione Abrir Execução. Abra a execução para visualizar o cromatograma. Selecione Integração de pico no menu superior para marcar os picos obtidos.
Selecione a guia Frações para visualizar as frações que contêm proteína eluída.
