Para começar, monte um microscópio de dissecação, duas pinças com pontas finas, tesoura, uma agulha de seringa de um mililitro e papel de filtro em uma plataforma de trabalho. Em seguida, usando uma tesoura de cotovelo, nuclee os olhos de um camundongo anestesiado. Coloque os olhos em um prato de vidro contendo 4% de paraformaldeído e 0,2% de ácido pícrico em tampão fosfato 0,1 molar.
No microscópio de dissecação, usando uma seringa de um mililitro, faça um furo no limbo da córnea e corte o segmento anterior com uma tesoura. Use uma pinça para remover a lente da superfície interna da retina. Agora, usando duas pinças, descasque cuidadosamente a esclera até que a retina esteja completamente isolada da ocular.
Posteriormente, corte a retina em quatro pedaços. Após fixação noturna e solução de paraformaldeído a 4%, lave os tecidos retinianos em PBS 0,01 molar seis vezes por 10 minutos cada. Incube o tecido retiniano em borohidreto de sódio a 1% em PBS 0,01 molar por 30 minutos.
Novamente, lave as seções da retina em PBS de 0,01 molar pelo menos seis vezes. Em seguida, remova o vítreo com papel de filtro. E usando uma lâmina de barbear de dois gumes, corte a retina em pequenas seções entre 100 e 300 micrômetros.
Lave as listras retinianas em PBS 0,01 molar seis vezes por 10 minutos cada antes de incubá-las com o Reagente A e o Reagente B do kit ABC por dois dias. Em seguida, lave as listras retinianas em tampão tris de 0,05 molar três vezes por 10 minutos cada. Pré-incube as listras retinianas com 5% de Reagente 1 e 5% de Reagente 3 do diaminobenzeno, ou kit DAB, em água destilada por uma hora em temperatura ambiente.
Para corar as listras da retina com DAB, adicione o mesmo volume de solução de três tubos no kit DAB em sequência. Sob o microscópio de dissecação, observe a condição de coloração. Lave as tiras de retina com tampão tris de 0,05 molar três vezes por 10 minutos cada.
Por fim, lave as tiras em PBS 0,01 molar seis vezes por 10 minutos cada. Nos experimentos controle, pedículos de cone com duas fitas e bastonetes esféricos com uma fita não apresentaram imunorreatividade na ausência de anticorpos primários. A proteína quinase C alfa identificou células bipolares de bastonetes na retina.
O DAB em pé mostra a presença de dendritos de células alfa e bipolares da proteína quinase C, formando sinapses com terminais de bastonetes e cones na camada plexiforme externa. Além disso, o produto de reação DAB auxilia na identificação de terminais de células bipolares de bastonetes e processos axonais na camada plexiforme interna. As células amácrinas de imunorreatividade da substância P mostraram-se pré-sinápticas às células amácrinas negativas da substância P.
Além disso, as células amácrinas de imunorreatividade da substância P eram pós-sinápticas aos terminais bipolares nos níveis da subcamada três e da subcamada cinco da camada plexiforme interna, respectivamente.
