Para começar, remova o criovíolo contendo células CD34+ do sangue do cordão umbilical do freezer. Descongele as células em banho-maria antes de transferi-las para um tubo de 50 mililitros. Enquanto agita o tubo gota a gota, adicione 10 vezes o volume das células de IMDM pré-aquecido contendo 50% de FBS e 0,1 miligrama por mililitro de DNase ao tubo.
Centrifugar a suspensão da célula a 500 G durante cinco minutos. Ressuspenda o pellet em 20 a 40 microlitros de PBS contendo penicilina e estreptomicina. Armazene as células no gelo até o uso.
Prepare uma seringa de três mililitros com uma agulha de calibre 27 de meia polegada. Prepare uma seringa de insulina de 0,5 mililitro com uma agulha de calibre 29 e 12,7 milímetros contendo a suspensão de células CD34 + do sangue do cordão umbilical. Em seguida, prepare uma seringa de insulina de um mililitro com uma agulha de calibre 29 de 0,5 polegadas com 100 microlitros de buprenorfina.
Transfira o mouse anestesiado para um cone nasal e belisque o dedo do pé para confirmar sua prontidão para a injeção. Coloque o mouse de costas e flexione as patas traseiras. Para proteger as patas traseiras, coloque o polegar da mão não dominante no pé, o dedo médio no quadril e o dedo indicador na parte externa do fêmur.
Arranque suavemente o cabelo ao redor da rótula e limpe a área com um cotonete embebido em álcool. Agora, usando uma seringa de três mililitros com uma agulha de meia polegada de calibre 27, faça um furo suavemente na pele em direção ao fêmur. Quando a agulha estiver no osso, gire-a no sentido horário até que toda a agulha esteja no osso.
Remova a agulha usando uma rotação no sentido anti-horário até a metade. Limpe ao redor da agulha com um cotonete embebido em álcool e continue a girar a agulha no sentido anti-horário para removê-la completamente. Em seguida, insira a seringa de insulina de 0,5 mililitro contendo suspensão celular na haste femoral.
Assim que a agulha estiver no osso, solte o aperto na perna e injete suavemente 25 microlitros de suspensão no fêmur. Finalmente, injete a buprenorfina por via subcutânea e retorne o camundongo à sua gaiola de origem, permitindo que ele se recupere da anestesia.
