Para começar, semeie 20 milhões de células da medula óssea de camundongos recém-nascidos por frasco T75 em 10 mililitros de DMEM completo contendo 2,5 mililitros de sobrenadante de células 10% L929. Incubar o frasco de cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco dias. No terceiro dia de diferenciação, adicionar dois mililitros de meio condicionado L929 ao frasco.
Sob um microscópio invertido com aumento de 20x, observe diariamente as células. Para colher os macrófagos no quinto dia, aspirar os meios de diferenciação do balão. Lave as células com cinco mililitros de PBS para remover as células não aderentes e as proteínas séricas.
Adicione cinco mililitros de 0,05% de tripsina EDTA ao frasco e incube a 37 graus Celsius na incubadora com 5% de dióxido de carbono. Após cinco minutos, adicione cinco mililitros de DMEM e pipeta para separar as células. Centrifugar a suspensão celular a 350 g durante cinco minutos.
Dissocie o palato celular em um mililitro de DMEM completo. Conte as células em um contador de células automatizado. Na presença de sobrenadante de células L929, as células da medula óssea foram diferenciadas em macrófagos em cinco dias.
A formação de células fusiformes foi observada a partir do segundo dia, com quase metade exibindo essa morfologia no terceiro dia e a maioria no quinto dia.
