Para começar, adquira as imagens das seções de CHC imunomarcadas. Baixe e abra o QuPath 0.4.3. exe no computador.
Crie uma nova pasta com um nome adequado para organizar projetos QuPath. Clique no botão criar projeto no canto superior esquerdo do software e selecione a pasta recém-criada. Em seguida, arraste as imagens digitalizadas para a janela do software QuPath.
Quando uma nova janela aparecer, selecione definir tipo de imagem e clique em H-DAB, seguido de importar. Para visualizar as imagens importadas, verifique a lista na janela esquerda do menu e clique duas vezes em uma imagem para abri-la. Selecione o arquivo no menu principal e prossiga para salvar as imagens como um projeto.
Escolha as ferramentas de pincel ou varinha no menu principal para anotar a área do tumor. Em casos de regiões tumorais descontínuas, anote cada região separadamente. Pressione e segure a tecla control enquanto seleciona todas as regiões.
Em seguida, clique com o botão direito do mouse e escolha editar vários e selecione mesclar selecionados. Depois, clique em automatizar no menu principal e selecione mostrar editor de script. Copie o script necessário, cole-o no editor de scripts e clique em executar.
Como alternativa, selecione a ferramenta polilinha no menu principal para desenhar com precisão uma borda, separando os ninhos de células malignas e o tecido não tumoral adjacente. Em seguida, selecione a borda no menu principal, escolha objetos, clique em anotação e selecione expandir anotações. Defina o raio de expansão para 500 micrômetros e escolha plano para a tampa da linha.
Ative a remoção do interior e certifique-se de que a restrição ao pai esteja ativada. Agora clique com o botão direito do mouse na anotação recém-criada. Selecione editar single e escolha dividir.
Para nomear as regiões anotadas corretamente, clique com o botão direito do mouse na anotação na lista à esquerda. Selecione definir propriedades e insira os nomes apropriados para as regiões de margem interna e externa. Defina a área restante do tumor como o centro do tumor.
Estenda a área peritumoral de 500 micrômetros de largura adjacente à margem externa, conforme demonstrado anteriormente. Para uma análise detalhada de pixels, selecione a ferramenta retângulo no menu principal. Em seguida, anote uma região, abrangendo todos os tipos de pixels a serem distinguidos.
Em seguida, navegue até o menu principal. Selecione analisar e clique em pré-processamento. Em seguida, clique em estimar vetor de mancha.
Ao ativar o editor de manchas visuais, selecione automático e clique em OK. Nomeie o vetor de coloração estimado H-DAB. Para análise de pixels, um método alternativo envolve o uso da ferramenta retângulo do menu principal para destacar uma pequena seção de um núcleo corado com hematoxilina.
Em seguida, acesse o menu à esquerda e selecione a imagem. Em seguida, clique duas vezes na mancha um e selecione sim. Novamente, use a ferramenta retângulo para anotar uma pequena região, mostrando coloração positiva com DAB.
Depois disso, selecione a imagem no menu à esquerda e clique duas vezes na mancha dois, seguida de sim. Para avaliar a fração de área de células imunes positivas no menu principal, clique na opção classificar, selecione a classificação de pixels e clique em criar limiar. Depois disso, defina a resolução para alta, selecione o canal DAB e aplique um pré-filtro gaussiano com sigma de 0.5.
Ajuste o limite entre 0,2 e 0,3. Defina pixels acima do limite como positivos e abaixo do limite como negativos. Para a seleção da região, opte por qualquer anotação.
Dê um nome ao classificador. Em seguida, clique em salvar, medir e ok. Para documentar as descobertas, copie os resultados exibidos no menu do lado esquerdo e transfira-os para uma planilha.
Selecione a medida no menu principal superior como um método alternativo. Em seguida, escolha mostrar medidas de anotação. Selecione copiar para a área de transferência e cole esses resultados em uma planilha para obter um registro detalhado.
Por fim, clique com o botão direito do mouse na imagem, navegue até multivisualização e clique em fechar visualizador para fechar a imagem. A proteína CD117 foi predominantemente observada nas membranas citoplasmáticas de células arredondadas no estroma tumoral e nos espaços paravasculares. Células CD117-positivas também foram observadas em cápsulas tumorais e áreas paravasculares da margem externa e paratumoral.
A proteína NKp46 foi observada principalmente nas membranas citoplasmáticas de células arredondadas em espaços semelhantes a sinusóides, no estroma do centro tumoral e na margem interna. Células positivas para Nkp46 foram observadas em cápsulas ao redor de ninhos tumorais e estroma de tratos portais na margem externa e regiões peritumorais. A proteína CD1a foi observada principalmente nas membranas citoplasmáticas de células arredondadas, espalhadas ou em agregados no estroma e espaços sinusóides nas regiões do centro do tumor e da margem interna.
Células CD1a positivas foram encontradas em sinusóides e epitélio biliar na região paratumoral.
