Para começar, obtenha o organoide tumoral derivado do paciente ou PDTO e adicione três mililitros de meio de cultura DMEM F / 12 enriquecido fresco ao PDTO a cada três a quatro dias. Usando o irradiador da plataforma de radiação de pesquisa com pequenos animais, irradie as cúpulas contendo PDTO no modo de campo aberto. Imediatamente após a irradiação, lave cada PDTO contendo cúpula de Nagrigel com dois mililitros de meio DMEM F / 12 enriquecido.
Em seguida, usando um P 1000, ressuspenda o PDTO em um a três mililitros de uma enzima recombinante obtida comercialmente. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius. Centrifugue o tubo para pellet as células e aspire o sobrenadante para deixar aproximadamente um mililitro de enzima recombinante no tubo.
Em seguida, lave as células com meio DMEM F/12 enriquecido e filtre a suspensão celular em um filtro de malha de 40 micrômetros para eliminar aglomerados de células, core uma pequena amostra das células filtradas com 10% de azul de tripina em PBS e conte-as em um contador de células automatizado. Ressuspenda as células para atingir uma densidade de 800 células em 50 microlitros de meio enriquecido com 66% de magrigel. Próxima placa, cada cúpula em poços separados de uma placa de cultura de 48 poços compatível com imagens e incubar a placa para permitir que o magrigel solidifique.
Finalmente, adicione 0,5 a um mililitro de meio DMEM F / 12 enriquecido a cada poço para imagens ao vivo.
