Iniciar a cultura cinco vezes 10 até o quinto DF-1 células por poço em uma placa de seis poços com DMEM suplementado com 10% de FBS. Quando as células atingirem 80% de confluência, descarte o soro contendo meio de cultura celular. Depois de lavar as células três vezes com PBS, adicione dois mililitros de meio de cultura de células sem soro, seguido de solução do vírus IBDV em cada poço.
Após uma hora de absorção do vírus, lave as células com PBS três vezes e incube-as por 24 horas com dois mililitros de DMEM suplementado com 2% de FBS. Adicione 500 microlitros de tripsina por poço, seguido de dois mililitros de DMEM com 10% de FBS após um minuto. Centrifugar as células e remover cuidadosamente o sobrenadante.
Depois de ressuspender o pellet celular em PBS, vórtice suavemente o tubo por três segundos e centrifugue as células conforme descrito anteriormente. Usando um hemocitômetro ao microscópio, conte as células para ressuspendê-las em um volume apropriado de tampão de coloração por citometria de fluxo e vórtice a suspensão. Adicione 100 microlitros da suspensão de célula única em um tubo de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros.
Incube as células infectadas pelo IBDV e simule as células de controle com um micrograma de anticorpo apropriado no gelo por 30 minutos no escuro. Suavemente tubo de vórtice a cada 10 minutos. Lave as células com um mililitro de tampão de coloração por citometria de fluxo e centrifugue o tubo.
Depois de descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 100 microlitros de tampão de coloração por citometria de fluxo. Em seguida, incubar as células com 10 microgramas por mililitro de iodeto de propídio durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. E adicione 400 microlitros de tampão de coloração por citometria de fluxo para o ensaio de citometria de fluxo.
Realize citometria de fluxo com o tubo de controle em branco seguido pelos tubos corados individuais para ajustar os parâmetros de tensão e compensação antes de executar todas as amostras. A citometria de fluxo indicou que um número considerável de células foi positivo para fragmentos N-terminais de Gasdermin E de galinha após a infecção por IBV, enquanto os fragmentos C-terminais de Gasdermin E de galinha clivada foram quase indetectáveis por citometria de fluxo usando coloração de antígeno de superfície de membrana. A população de fragmentos N-terminais de células duplamente positivas de Gasdermin E de galinha e iodeto de propídio em células infectadas por IBDV foi significativamente maior do que a de controles infectados simulados, sugerindo que essa parte das células infectadas por IBDV estava sofrendo piroptose.
