Comece revestindo a matriz extracelular em inserções de cultura de células para cultura de monocamada 2D derivada de organoide. Aplique 100 microlitros de revestimento de matriz extracelular na câmara apical de cada inserto de cultura de células preparado e recoloque a tampa. Em seguida, incube a placa de cultura de células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora.
Para células organoides retais, após a incubação, substitua o revestimento da matriz extracelular por meio de cultura de monocamada retal e incube durante a noite. Após a digestão enzimática dos organoides e a filtração em células individuais, centrifugar a suspensão celular a 200 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius e rejeitar em seguida o sobrenadante. Em seguida, prepare 200 microlitros das suspensões celulares por inserto de cultura de células em meios de cultura monocamada.
Recupere a placa de cultura de células de 24 poços contendo inserções de cultura de células revestidas com matriz extracelular. Usando sucção a vácuo, esvazie cuidadosamente a câmara apical de cada inserto de cultura de células para evitar a ruptura do revestimento. Aplique cuidadosamente 200 microlitros da suspensão de célula única na câmara apical de cada inserto de cultura de células.
Adicione 500 microlitros do meio de cultura monocamada adequadamente suplementado à câmara basolateral de cada poço. Em seguida, incube a placa em uma incubadora umidificada para promover a adesão e o crescimento celular, formando uma monocamada 2D confluente no inserto de cultura de células. Troque os meios de cultura nas câmaras apical e basolateral a cada dois dias, começando 48 horas após a semeadura celular.
Para coloração imunofluorescente de monocamada 2D derivada de organoide, corte cuidadosamente a membrana do inserto de cultura de células com uma lâmina de bisturi e coloque o inserto de cultura de células em uma lâmina de vidro. Adicione a mídia de montagem em uma lamínula e coloque-a na lâmina de vidro antes de observar as células. Um dia após a semeadura de organoides maduros dissociados em uma inserção de cultura de células, uma monocamada 2D pareceu se formar.
A microscopia eletrônica de varredura revelou microvilosidades e demarcação celular bem desenvolvidas na superfície apical das monocamadas 2D cinco dias após a semeadura. A coloração imunofluorescente das monocamadas 2D confirmou a presença de borda em escova apical, junções de aderência basolateral e células caliciformes produtoras de muco em monocamadas 2D derivadas de organoides ileais e retais.
