Para começar, prepare a solução de revestimento apropriada no tampão de Tyrode modificado e cubra uma microlâmina de oito poços, incubando-a por duas horas a 37 graus Celsius. Em seguida, lave a microlâmina revestida duas vezes com o tampão de Tyrode modificado. Incube a microlâmina no tampão de Tyrode modificado contendo cinco miligramas por mililitro de BSA por pelo menos 30 minutos para extinguir a adesão inespecífica.
Para preparar plaquetas lavadas, centrifugue sangue total anticoagulado com citrato a 200 G por 20 minutos para obter plasma rico em plaquetas. Em seguida, adicione indometacina e PGE1 ao plasma rico em plaquetas e centrifugue a 500 G por 10 minutos. Ressuspenda o sedimento de plaquetas resultante no tampão HEPES de Tyrode modificado a 37 graus Celsius para atingir uma densidade de quatro vezes 10 elevado a sete plaquetas por mililitro.
Deixe as plaquetas isoladas descansarem por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione solução de DHE à suspensão plaquetária para atingir uma concentração final de 10 micromolares e incube a 37 graus Celsius por um minuto. Após a incubação, remova a solução de bloqueio da microlâmina e posicione-a no microscópio para imagem.
Em seguida, dispense suavemente as plaquetas. Use uma lente de imersão em óleo 40X em um microscópio confocal invertido para monitorar a conversão de DHE em 2-hidroxitídeo. Imagem por 10 minutos, coletando imagens a cada 10 segundos.
Para monitorar a geração de ânions superóxido em resposta a um agonista, adicione um agonista solúvel 10 minutos após a distribuição das plaquetas e colete imagens de fluorescência por mais 10 minutos. Utilizando este protocolo, a geração de radicais superóxido foi estudada durante a adesão plaquetária ao colágeno ou fibrinogênio, e a partir de plaquetas aderidas à PLL estimuladas com trombina.
