Para começar, obtenha plasma rico em plaquetas centrifugando o sangue total anticoagulado com citrato a 200g por 20 minutos. Adicione indometacina e PGE1 ao plasma e centrifugue a 500g por 10 minutos. Ressuspenda o grânulo de plaquetas resultante no tampão HEPES de Tyrode modificado a 37 graus Celsius para obter uma densidade de 2x10 ^ 8 plaquetas por mililitro.
Descanse as plaquetas por 30 minutos a 37 graus Celsius. Adicione DETC a uma concentração final de cinco micromolares e deferoxamina a uma concentração final de 25 micromolares na suspensão plaquetária, seguido de CMH a uma concentração final de 200 micromolares. Coloque as amostras em cubetas de agregação equipadas com ímãs de agitação revestidos de Teflon e carregue-as no agregometro.
Após um minuto, adicione estímulos como trombina ou colágeno e incube por 10 minutos. Após a incubação, transfira a suspensão de plaquetas da cubeta de agregação para um tubo de microcentrífuga e gire rapidamente a 6.000g por 10 segundos. Carregue 50 microlitros do sobrenadante em micropipetas capilares e sele com cera de vedação EPR.
Transfira amostras para o scanner EPR e defina os parâmetros no scanner. Estimar a oxidação de CMH em radical CM como a área sob a curva dos picos de EPR registados. Obter uma curva de calibração utilizando o radical CM disponível no mercado.
A intensidade do sinal de EPR nas amostras foi proporcional à intensidade dos picos de EPR. A especificidade da detecção foi confirmada com sequestrantes de ROS e inibidores seletivos de enzimas geradoras de ânion superóxido. Os dados de estimulação plaquetária com trombina ou colágeno na presença do inibidor seletivo VAS2870 sugeriram que as NADPH oxidases são a principal fonte de ânions superóxido plaquetário em resposta a ambos os agonistas.
