Para começar, transfira os ovários excisados de um peixe-zebra para uma placa de seis poços contendo dois mililitros de solução de dissociação celular. Incube os ovários a 28,5 graus Celsius por duas a três horas. Adicione dois a três mililitros de meio L15 pré-aquecido ao tampão para interromper a digestão.
Em seguida, coloque um filtro de células de 70 micrômetros em outro poço da placa de seis poços. Adicione o meio L15 ao poço, garantindo que o nível médio seja mais alto do que o filtro. Agora, use uma pipeta para puxar o meio digestivo através do filtro de células.
Remova o excesso de meio com uma pipeta. Adicione quatro mililitros de meio L15 fresco no poço e ressuspenda suavemente os oócitos. Após alguns minutos, pipetar o sobrenadante.
Para selecionar os oócitos para controle de qualidade, transfira-os para uma placa de 35 milímetros de largura contendo meio L15 fresco. Observe os oócitos sob um microscópio óptico usando uma ampliação de 10X ou mais. Use uma ferramenta de injeção contundente para remover quaisquer fragmentos de células, oócitos em estágio um ou qualquer outro oocytes em estágio.
Para confirmação do estágio de crescimento, adicione Hoechst 33342 ao meio L15 contendo os oócitos e incuba. Observe os oócitos com um microscópio de fluorescência sob excitação a laser UV. Escolha cuidadosamente os oócitos que não atendem aos critérios desejados com uma agulha.
O ovário juvenil apresentou abundância de oócitos transparentes no estágio um acompanhados por uma população menor de oócitos no estágio dois. Os ovários de peixes adultos mostraram uma predominância de oócitos opacos em estágio tardio de dois a três ovócitos. O método de referência resultou em numerosos núcleos de células da granulosa corados na superfície dos oócitos, envolvendo densamente os oócitos.
Em contraste, o método modificado permitiu a separação de oócitos em estágio um desprovidos de coloração dos núcleos das células da granulosa.
