Para começar, esterilize a superfície de um besouro Monochamus alternatus e Tribolium castaneum famintos por 24 horas com água sanitária, etanol e água destilada. Para induzir a infecção fúngica, primeiro mergulhe os galhos de pinheiro ou farelo de trigo na suspensão de conídios por 10 segundos. Em seguida, mergulhe os besouros na suspensão de conídios.
Após a secagem, coloque um besouro e um galho em um tubo estéril de 50 mililitros. Crie os besouros em uma incubadora não umidificada a 25 graus Celsius. Após a incubação, transfira os besouros mortos para um novo tubo de 50 mililitros e coloque um pedaço de algodão estéril e úmido dentro do tubo.
Disseque os corpos do besouro infectado com infecções fúngicas em posições como antenas, cabeça, tórax, abdômen, asas e pernas. Corte plugues de disco de cinco milímetros de colônias de fungos maduros. Coloque os tecidos do besouro infectado em glutaraldeído pré-resfriado a 2,5% a quatro graus Celsius por dois dias.
Em seguida, lave as amostras três vezes em tampão fosfato a 0,1% por cinco minutos e desidrate em concentrações crescentes de etanol por 10 minutos cada. Seque as amostras em um liofilizador a vácuo e, em seguida, observe as estruturas fúngicas sob um microscópio eletrônico de varredura. Trate o farelo de trigo com uma suspensão de conídios por 10 segundos e, após a secagem, transfira-os para uma placa de Petri.
Mergulhou os besouros T.castaneum na suspensão de conídios por 10 segundos antes de colocá-los na placa de Petri contendo farelo de trigo. Após a incubação, conte os besouros mortos da placa. Extraia o DNA genômico de fungos entomopatogênicos parasitas usando o kit de isolamento de DNA genômico de fungos.
Usando os conjuntos de primers fornecidos, prepare uma mistura de reação de PCR para amplificação específica do gene. Após o sequenciamento, alinhe a sequência de nucleotídeos usando o ClustalX 2. Por fim, realize a análise filogenética usando o MEGA 6 com base no método da máxima verossimilhança.
Fungos parasitas como Aspergillus austwickii, Akanthomyces attenuatus e Scopulariopsis alboflavescens causaram sintomas significativos de infecção em M. alternatus. As observações de MEV apoiaram ainda mais as características morfológicas desses fungos parasitas na superfície dos besouros. A atividade entomopatogênica apresentou taxas de mortalidade significativamente maiores em fungos parasitas em comparação com o grupo controle.
A árvore filogenética multigênica demonstrou distâncias genéticas entre as três espécies de fungos parasitas e outras espécies dentro de seus respectivos gêneros.
