Para isolar as células-tronco neuro ou NSCs das zonas subventriculares dos neurônios dissecados ou SVZ, corte cada SVZ em quatro a cinco pequenos pedaços para facilitar a desagregação do tecido. Usando uma pipeta pasteur de plástico estéril, transfira os SVZs picados para um tubo de centrífuga de 15 mililitros, garantindo que nenhum fragmento seja deixado na placa. Deixe o tecido sedimentar no fundo do tubo antes de remover o DPBS restante.
Adicione 500 microlitros de mistura enzimática filtrada para as duas SVZs por cérebro e incube o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, adicione cinco mililitros de meio de controle pré-avisado a 37 graus Celsius a cada amostra. Centrifugar a amostra a 300 g durante cinco minutos.
Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma micropipeta ou uma bomba de vácuo. Usando uma pipeta de vidro de pasto polido a fogo, adicione um mililitro de meio de controle ao pellet. Desagregar mecanicamente o pellet cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo 10 a 20 vezes até obter uma suspensão celular homogênea.
Em seguida, adicione quatro mililitros de meio de controle e misture por inversão para lavar as células. Após centrifugação a 300 g durante cinco minutos, ressuspender homogeneamente o sedimento resultante em um mililitro de meio completo, pipetando 10 vezes para cima e para baixo. Depois de diluir uma parte de uma alíquota da suspensão celular com uma parte de azul de tripano, contar as células usando uma câmara de Neubauer ao microscópio.
Garanta a desagregação celular no nível de célula única antes de semear as células igualmente em oito poços de uma placa de 48 poços em um volume final de 500 microlitros de meio completo. Incube as células por cinco a sete dias para permitir a formação das neuroesferas primárias.
