Usando o kit recomendado, proceda à preparação de 95 microlitros da solução de nucleofecção em um tubo de 1,5 mililitro para cada condição de nucleofecção desejada. Prepare também um frasco T25 cheio de quatro mililitros de meio completo pré-aquecido por condição e mantenha-o na incubadora até o uso. Para realizar a nucleofecção, centrifugue o número desejado de células por cinco minutos a 300 G antes de remover o sobrenadante.
Adicione um mililitro de DPBS e ressuspenda o pellet homogeneamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Depois de repetir a centrifugação, ressuspenda o pellet em 95 microlitros de solução de nucleofecção. Combine os 95 microlitros de células com uma solução pré-misturada contendo cinco microlitros de cada plasmídeo selecionado para nucleofecção.
Depois de transferir esta solução para uma cubeta, coloque-a no dispositivo nucleofector para nucleofectar as células com os plasmídeos usando o programa de células-tronco neurais otimizado do sistema nucleofector. Depois de completar a eletroporação, usando a pipeta Pasteur fornecida no kit, introduza cuidadosamente o meio completo quente na cubeta. Transferir o conteúdo da cubeta para o balão T25 previamente preparado contendo meio completo pré-aquecido.
Incube as células nucleofectadas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três a cinco dias e visualize as neuroesferas nucleofectas.
