Para começar, enxágue as lamínulas revestidas com gelatina reticulada com glutaraldeído em PBS contendo cálcio e magnésio cerca de cinco vezes em um agitador orbital. Durante os três primeiros enxágues, levante as lamínulas usando uma pinça estéril para permitir o enxágue completo do glutaraldeído. Em seguida, substitua o meio de cultura de RECs de camundongo por meio fresco suplementado com ácido ascórbico filtrado estéril.
Após 15 dias de tratamento, enxágue as células com PBS livre de cálcio e magnésio. Incube as células em 250 microlitros de tampão de descelularização quente por dois a três minutos. Confirme a descelularização das células sob um microscópio de contraste de fase.
Pipetar suavemente o tampão sem perturbar a matriz subendotelial secretada pelo REC. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de PBS em cada poço. Depois de remover o PBS, adicione 200 microlitros de DNase livre de RNase.
Incube a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos para remover todos os detritos celulares. Em seguida, visualize a matriz subendotelial fibrosa em macroescala sob um microscópio de contraste de fase. Em seguida, use um microscópio confocal para visualizar as fibras de matriz em nanoescala mais finas com ampliação de 100x.
Agregados de matriz subendotelial foram observados nas lamínulas de vidro após a descelularização de culturas de 10 ou 15 dias de CERs humanas ou de camundongos. A microscopia confocal das matrizes descelularizadas mostrou uma matriz densa de colágeno-IV e fibronectina nanofibrilar.
