Para começar, coloque um frasco de células mononucleares de sangue periférico humano criopreservado em banho-maria a 37 graus Celsius. Depois de descongelado, transfira a suspensão PBMC para um tubo de 15 mililitros contendo nove mililitros de TGM. Centrifugar o tubo a 300 G durante cinco minutos após ter pipetado uma alíquota da suspensão celular para contagem.
Ressuspenda o PBMC peletizado em três mililitros de TGM. Em seguida, transfira o volume necessário de suspensão celular para uma placa de seis poços. No dia anterior à ressuscitação celular, transfira 100 microlitros de esferas magnéticas de imunoglobulina G de camundongo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Adicione um mililitro de PBS aos tubos e coloque-os em um suporte magnético para lavar as contas. Ressuspenda as esferas em 100 microlitros de PBS. Em seguida, adicione os anticorpos à suspensão.
Use uma pipeta para misturar suavemente a suspensão. Coloque a suspensão em um balancim a quatro graus Celsius durante a noite. Depois de lavar as esferas em PBS como feito anteriormente, ressuspenda-as em 100 microlitros de PBS.
Agora adicione grânulos imunológicos revestidos com NHCD3 hCD28 à placa e incuba. Após 48 horas de incubação, misturar e transferir a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Coloque o tubo em um suporte magnético por três minutos.
Em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 mililitros. Semeie cinco vezes 10 elevado a cinco PBMC em 300 microlitros de TGM nos poços de uma placa plana de 48 poços. Pipetar 200 microlitros de caldo lentiviral nos poços correspondentes.
Em seguida, adicione sulfato de protamina a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro antes de centrifugar. Pipete 300 microlitros do sobrenadante de cada poço e, em seguida, adicione um mililitro de TGM fresco em cada poço. Coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono.
Adicione 0,5 a dois mililitros de TGM fresco ao prato a cada dois ou três dias. Em seguida, transfira as células para uma placa de 12 poços, seguida por uma placa de seis poços até que a densidade total de células atinja 6 milhões em um volume de quatro mililitros.
