Para começar, coloque as células T transduzidas por CAR cultivadas em duas placas de 12 poços contendo dois mililitros de TGM. Coloque uma placa diretamente em uma incubadora umidificada sob 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Coloque a outra placa em uma câmara incubadora móvel de dióxido de carbono e nitrogênio com o nível de oxigênio predefinido em 1% Colete 500.000 células das placas a cada 24 horas em ambas as condições em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Centrifugar os tubos a 500 G durante cinco minutos. Depois de remover o sobrenadante, pipetar suavemente um mililitro de PBS no pellet da célula. Ressuspenda as células peletizadas em 50 microlitros de tampão FACS.
Em seguida, adicione 50 microlitros de uma diluição de um a 100 de anticorpo anti-bandeira conjugado com ficoeritrina. Pipete a suspensão para misturar bem. Após a incubação, adicione um mililitro de tampão FACS a cada tubo.
Centrifugar a suspensão mista a 500 g durante cinco minutos. Agora, pipete os sobrenadantes de cada tubo. Em seguida, ressuspenda as células em 200 microlitros de tampão FACS.
Transferir a suspensão celular resultante para tubos de citometria de fluxo de cinco mililitros. Realize citometria de fluxo na suspensão celular para determinar a expressão do receptor de antígeno quimérico de superfície. Configure novos tubos como blank e CAR.
Clique no canal FSCA, FSCH, SSCA, SSCH, PE e FITC. Em seguida, crie quatro gráficos de dispersão para identificar sequencialmente células individuais, células vivas, células GFP positivas e PE positivas. Defina parâmetros para coletar 10.000 células vivas individuais.
Clique em adquirir dados. Depois que a coleta de células estiver estável, clique em registrar dados. Para determinar a localização das comportas de acordo com o controle negativo, bloqueie as células positivas para EGFP e ficoeritrina para medir a positividade da ficoeritrina e a intensidade média de fluorescência.
O CAR sensível à hipóxia por dois direcionados mostrou expressões significativamente altas de CAR sob condições hipóxicas em relação às condições normóxicas.
