Para começar, semeie 1000 células-alvo em cada poço de duas placas de cultura de tecidos de fundo plano de 96 poços contendo 200 microlitros de FBSDMEM. No dia seguinte, pipetar cuidadosamente 100 microlitros do sobrenadante do topo de cada poço. Adicione células T receptoras de antígeno quimérico ou células T não transduzidas em 100 microlitros de FBSDMEM em diferentes proporções.
Coloque uma placa em uma atmosfera de oxigênio a 21% e a outra em uma câmara incubadora móvel de nitrogênio de dióxido de carbono sob atmosfera de oxigênio a 1%. Após 24 horas de co-cultura, use uma pipeta para transferir cuidadosamente todo o sobrenadante para uma nova placa de 96 poços com fundo em U. Armazene o sobrenadante a menos 20 graus Celsius para detecção de citocinas.
Agora adicione 60 microlitros de tampão de lise passiva em cada poço experimental das placas pretas de fundo plano de 96 poços. Coloque as placas em um agitador por 30 minutos para garantir uma lise celular eficiente. Adicione 60 microlitros de substrato de luciferase de vaga-lume em cada poço experimental.
Use um leitor de microplacas para medir a atividade da luciferase imediatamente. Finalmente, calcule a porcentagem de citotoxicidade normalizada com a equação fornecida. O CAR de HER2 sensível à hipóxia foi capaz de matar efetivamente as células-alvo, independentemente de a atmosfera ser hipóxica ou normóxica.
Em contraste, as células CAR T HER2-BBz-ODD exibiram citotoxicidade significativamente mais fraca sob condições normóxicas para todas as condições.
